化学変化 chemical change

Ex. HCl + NaOH → NaCl + H₂O

Ex. H⁺ + OH^- → H₂O

[ 化学反応は必ず活性化状態を通る ]
N₂ + 3H₂ + 54 kcal (吸収活性化エネルギー)

= 2NH₃ + 11 × 2 kcal (反応熱) + 54 kcal (放出 = 22 + 54)

[ 触媒 | 酵素学 | 反応速度論]

化学平衡 chemical equilibrium

_ v₁
X ⇄ Y__[v₁ = v₂]
_ v₂

光化学反応 photochemical reaction

化学量論 (stoichiometry)

質量保存の法則
定比例の法則
倍数比例の法則

触媒作用は化学平衡自体を変えることはない

白金片に水素吹き付けると燃える - 白金は減らない
2H₂ + O₂ → [白金(触媒)] → 2H₂O

N₂ + 3H₂ → 2NH₃ ル・シャトリエの原理: 発熱反応(400-500°C) - 圧力かける
空中酸素固定: 触媒 Fe₃O₄ (FeO, Fe₂O₃が中心)
1913 Mittasch: 実用触媒 (二重促進鉄触媒)
1913 Bosch: 反応装置開発 (Haber-Bosch法)
⇒ 爆薬合成、農業上は肥料として利用

CO₂ + H₂ → HC(ハイドロカーボン)
200 atm, 200-300°C, 触媒(catalyser) Fe₃O₄, Co (アルコールを含む, HC), Zn·Cr(+Cu) (methanolを含むHC)

ノーベル賞: 有機合成におけるパラジウム触媒クロスカップリング
触媒: 遷移金属錯体 → 有機ハロゲン化物と有機典型元素化合物の間でカップリング反応

反応 reaction (実際起るかどうか)

反応条件 Ex. O₂ + 2H₂ → 2H₂O: Pt触媒があれば常温で反応

触媒反応 catalysis or catalytic reaction

酵素 (enzyme)

0. 極微量で有効
1. 反応触媒 catalyst
   = 酵素: 生物体内で触媒作用を行うタンパク質
   A → [触媒/酵素] → P
   
2. 温度効果
3. pH効果 (v-pH関係)
4. 特異性 specificity

沈殿 → 麦芽中にアルコール不溶性物質存在
実験で、沈殿物(diastaseと命名)は、活性最適温度が50°C前後で100°Cを越えると失活

1. multose, sucrose, glycosidase, cyslase, nuclease, ATPase
2. Duclaux(1898)提唱。一般的酵素には-aseを消化酵素には -inを使用する。trypsin, papain, chymotrypsin
3. 作用にも-aseを用いる dehydrogenase(脱水素酵素)

動物は全て"アルブミン様物質"もちC/H/O/Nが一様であると指摘
師ベスツェリウス提案でこの"アルブミン様物質"をproteinと命名

イーストを擦り潰した抽出物でも(イーストがなくても)発酵することを発見(後談: 当時免疫療法研究盛ん → 彼らも免疫作成を狙い研究 → 本研究により発酵・消化をつかさどる物質(酵素)を生体から抽出し物質構造を解析する研究発展)
抽出物 = 含チマーゼ: ブドウ等をC₂H₅OHとCO2に分解する酵素の総称(10数種の酵素からなる)

「酵素作用とは錠前のと鍵との関係に例えられる」(現在この比喩は適切でないとされる)

分子量14600、129のアミノ酸からなる

酵素本体はタンパク質 = Urease: CO(NH₂)₂ →^enzyme 2NH₃ + CO₂
vs. Willstaetter: 反応本体はコロイド粒子であるという酵素の二元担体説を主張。コロイドにタンパク質が付着しそこで触媒反応が行われると考えた。当時コロイド化学が発展し実験に用いた酵素材料が50%もの糖分を含むインベルターゼinvertaseという糖タンパク性酵素であり当時の技術では精製不可能という不運があった

1930: ペプシン結晶化, 1931: トリプシン結晶化
これを契機に1937年以降酸化還元酵素の研究が盛んになる

= 最初に立体構造が明らかになった酵素

スーパーオキシドジスムターゼ(superoxide dismutase, SOD, 活性酸素分解酵素)発見

ペプチド固相合成法 → 化学的にリポヌクレアーゼ合成成功

触媒作用はタンパク質に依らない ☛ RNAワールド

抗体酵素(abzyme = antibody/enzyme)発見

0. 極微量で有効

1. 反応触媒 catalyst

2. 温度効果

2HI → H₂ + I₂
500°Cから10°C上昇するとvは44％上昇。分子衝突数は0.6%増えるはずだが、実際にはそれ以上増加

アーレニウスArrheniusの化学反応式

K: 反応速度定数, T: 絶対温度, R: 気体定数, E: 活性化エネルギー

em>Eは活性エンタルピーと呼ぶことがある

Q₁₀ = [V₁(T₁ + 10²)]/(v₁T₁)

最適温度は一般酵素は40-50°C。好熱菌Thermophilesでは80-90°C。好冷菌Psychrophilesでより低い

アレニウスプロット Arrhenius plot

3. pH効果 (v-pH関係)

4. 特異性 specificity

基質特異性

Ex. ウレアーゼ Urease
H₂N _\
____C=O + H₂O → CO₂ + 2NH₃
H₂N ^/

尿素

反応しない
H₃C _\__________________H₂N _\
____C=O___________________C=NH
H₃C ^/__________________H₂N ^/
アセトアミド (acetoamid)___グアニジン (guamidine)

作用(反応)特異性

アミノ酸 → 酸化還元

___→ アミノ基転移
___→ 脱水素反応

グルタミン合成酵素 (glutamine synthetase, GS)

リガーゼの一種: EC 6.3.1.2

Glu + NH3 + ATP → Glu + ADP + Pi

タンパク質一次構造
I型: 原核生物
II型: 真核生物

土壌細菌(Frankia, Rhizobium, Streptomyces)は両方持つ種存在

III型: 窒素欠乏状態で増加
→ 祖先遺伝子は同じ

補酵素 (coenzyme) + 補欠分子族 (prosthetic group)

補酵素 (coenzyme)

↔ 補欠分子族: 不可逆的な解離を行う

ホロ酵素 Holoenzyme

heme (Feを含む) + protein = cytochromes

フラビン (flavin)

NAD·NADP (pyridine nucleotides) (NAD·NADP)

ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド

ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸
R: -Rib-ADP
AH₂ + NAD⁺____⇄______A + NADH + H⁺: 結合性は弱い

リポイックアシッド (lipoic acid, or thioctic acid)

-S-S- → -SH, -SH: タンパク質のリジン残基と強く結合する

チアミン (サイアミン/アノイリン, thiamin(e))

CH₃COCOOH → [TPP] → CH₃CHO + CO₂
__(ピルビン酸 pyridoxal)___(アセトアルデヒド)
thiazole + P (酸) → [CO₂除去] → 最初の形へ

ピリドキシン pyridoxine

→ アミノ基転移反応(transamination reaction)

→ COOH-CO-(CH₂)₂-COOH (α-keto glutamate) +

CH₃-NCNH₂-COOH (alanine)

ビオチン biotin

葉酸 folic acid, FH₄

基本骨格

5-メチルテトラヒドロ葉酸 N⁵-Methyl FH₄
5,10-メチレンテトラヒドロ葉酸 N⁵,N¹⁰-Methylene FH₄
10-ホルミルテトラヒドロ葉酸 N¹⁰-Formil FH₄

CH₂OH-NH₂(-CH)-COOH___H-NH₂(-CH)-COOH

⇔ Methionine [CH₃-S-(CH₂)₂-HCNH₂-COOH] + FH₄

補酵素A (coenzyme A)

CoA-SH
Acetyl CoA (Co=A-S-acetyl group)
CH-C(=O)-S-CoA → CNがつくとcyanocobalamine

Ex. 有機物(ビタミン、糖、脂質等)、無機物(金属イオン)

有機物 organic substances

金属 metals

Zn²⁺, Mg²⁺, Mn²⁺, Fe²⁺ or Fe³⁺, Cu²⁺ or Cu⁺, Mo, K⁺, Na⁺

• Fe, Cu, Mo: 酸化還元反応(において電子の受け渡し, 2価3価で変化)
• Zn, Co: 加水分解反応
• Mg, Mn, Ca: 基質(特にリン酸化合物)と結合しキレート化合物をつくりコーリのいう真の化合物として酵素に認識される

単純タンパク質でアミノ酸残基、複合タンパク質で補欠分子族の存在部分

酵素基質複合体

1. 基質は酵素と結合して複合体を作り活性化される
2. この複合体の中で基質の変化が起こり、変化を受けた基質は反応生成物となって酵素から離れる
3. 酵素は再びものと遊離した状態に戻る。この過程で酵素は反応に直接関与するが反応の終了と共に遊離するので結果から見れば、酵素自身は反応の前後で変化していない
   _ A_→____E^※A^※___→_____E^※P^※____→____P
   基質__酵素基質複合体__酵素生成物複合体__反応生成物
   ____↖────────────E ─────────┘

酵素の活性化

速度論

律速段階(律速過程) rate-determing process: 反応速度の一番遅い反応が全反応を支配する

反応reaction

1. 中間生成物反応速度を0に近似する定常状態法
2. 律速段階
3. 実験

    ┌→ 反応機構決定する
    │   反応式導く
    │   速度式                            実験
    │   v = f(T, S)      照合(速度        速度の濃度
    │         │合否判定 パラメータ)      依存性
    No ←───┘                          Yes
                          実験結果の速度式に基づく解釈
                          (速度パラメータの物理的意味)
                          外的因子の影響を調べる
                          (温度、圧力、溶媒、pH等)
    No   素過程の解釈                      Yes

化学反応速度論 chemical kinetics

Ex. 衝突理論から反応速度定数求める。反応に関わる分子のSchrödinger方程式を近似的に解き化学反応ポテンシャル曲面から反応の軌跡を捉える。遷移状態理論から反応速度定数を求める

速度単位

1961年: 1U = 1 μmol/min, U/mg·protein, U/μmol·protein·min^-1
1972年 (SI): 1 katal·1 mol/s =

6 × 10⁸U, katal/kg·protein, katal/mol·protein·s^-1

⇒ H₂ + I₂ ↔ 2HI

0次反応

k₀: 速度定数 ⇒ 反応物濃度に依存しない
v = -dS/dt = dP/dt: 初速 P ≈ 0, k₂ (非常に小さいので)無視

初速度 initial velocity (IV): 酵素の初期反応を知る必要性
前定状状態 = 普通の反応では < 100 msecと短い時間(rapid mixing chamber内で測定)

Ex. N₂ + 3H₂ ↔ 2NH₃, K_c = [NH₃]²/([N₂][H₂]³)
Ex. C + CO₂ ↔ 2CO, K_c = [CO]²/[CO₂]

Ex. 平衡系 → 温度上昇 → 吸熱方向に平衡移動
Ex. N₂O₄ = 2NO₂ – 54.8 kJ → 温度上昇 → NO₂濃度↑, N₂O₄濃度↓

1次反応 = ミカエリス-メンテン式

[A] = 反応物濃度, [P] = 生成物濃度

-d[A]/dt = k[A] 両辺を積分
log[A₀] = -log[A] = kt/2.303
A₀: 反応前の濃度, A: 時間tにおける濃度

ln(c/c₀) = -kt
t_1/2 = ln2/k, Ex. ¹⁴C: t_1/2 = 5730 (yr) → k = ln2/t_1/2 = 0.693/5730
¹⁴C: 空気中一定割合 = ¹⁴Cは中性子反応で生成[自然状態] - 崩壊(一定速度)
生物体内に取り込まれ¹⁴C/g (C)は一定だが，死後¹⁴C取込みなし → 割合は1次反応(時間)に従い減少

大気中¹⁴CO₂放射能は12.5 cpm/g(C)

約3639年前に作られた

温度、光(放電、放射線)、触媒、形態(攪拌)

2次反応 (1次反応に起因)

(1) 消費速度 consumption rate ↔ (2) 生成速度 formation rate

絶対反応速度論 absolute kinetics

E: 見かけ上のエネルギー
ΔGの比較はΔSの相補的作用による働きが同程度行なわれており、単にΔHを見ただけで活性の度合いを論じるのは意味がない

               ΔS≠ (Kcal)    ΔG≠ (Kcal/mol)
ウサギ       -2.3 U              13.2
ヒラメ       -13.5 U              12.5

V = CTe^-ΔH≠/RT·e^ΔS≠/R (Eyring式) ⇒
V_p = V₀e^-PΔV≠/RT (圧力を考慮に入れたもの)

最大速度 maximum velocity: 酵素が基質飽和状態で示す反応速度

[E]: 全酵素濃度 total enzyme concentration
[E - ES]: 遊離酵素濃度 free enzyme concentration
[ES]: 酵素基質複合体 enzyme-substrate complex
[S]: 基質濃度 substrate concentration
[P]: 分解物質・生成物濃度 product concentration
k₊₁, k₊₂, k_-1, k_-2: 比率定数 rate constant

[S] ≫ [E]
d[ES]/dt = ([E] - [ES])·[ES]·k₊₁ … (3)
-d[ES]/dt = k_-1[ES] + k₊₂[ES]) … (4)
[S] ≫ [E]でありk_-2の反応は極少のため無視する

Mb, Hbの反応は酵素反応として等価 - 酵素反応モデルとしてよく使用

dP/dt = constant
d[ES]/dt = -d[ES]/dt = 0 (= 定常状態)
このとき τ ≈ 10^-3 sec
k₊₁([E] - [ES])[S] = k_-1[ES] + k₊₂[ES] … (5)
([E] - [ES])[ES]/[ES] = (k_-1 + k₊₂)/k₊₁ = K_M … (6)

Def. K_M: Micaelis-Menten constant (ミカエリス-メンテン定数)

[ES] = ([E][S])/(K_M + [S]) … (7)
(2)および上図から酵素速度反応は生産物の生成量で表される
v = k₊₂[ES] = k₊₂[E][S]/(K_M + [S]) … (8)

v = k₊₂[ES] = k₊₂[E][S]/(K_M + [S]) … (9)
V_max = k₊₂[E] … (10)
v/V_max = [S]/(K_M + [S]) … (11)
v = V_max[S]/(K_M + [S]) … (12)
(12)からv = V_max/2のとき1/2 = [S]/(K_M + [S]) なので

V_max/2 = V_max[S]/(K_M + [S])

∴ K_M＝ [S] 親和性を表す

K_M小: enzyme substrate affinity 大
K_M大: enzyme substrate affinity 小( = 酵素反応は進行しにくい)
K_Mは酵素反応速度を直接計ることによって求まる。酵素反応速度が不明瞭な場合にはLineweaver-Burk式(下式)によって補正

ラインウィーバー-バークグラフ(二重逆数プロット, Lineweaver-Burk graph or plot)

__

-1/K_M ⇒ K_Mが求まる: 両逆数プロットdouble reciprocal plotあるいはLineweaver-Burk's plotと呼ぶ

複合酵素系

I型: A → B → C → D
II型: AX + B → A + BX (Ex. 水素とリン酸基)

→ BX + C → B + CX (ex. 酸化還元反応、電子伝達系)

1. 酵素間距離: 近いほど反応速度は大きくなる ⇒ 細胞内では複合酵素系の酵素群は集まって存在している。Ex. ミトコンドリア(TCA回路、水素伝達系)、葉緑体(光合成)
2. 律速段階で調節

酵素濃度: 反応機構
基質濃度: 反応動力学定数(速度パラメータ) (K_m, V, k₀, k_cat, K_i等)
エフェクターの濃度: 反応機構と速度式

温度: 速度パラメータの物理的意味など
標準熱力学量(ΔG₀, ΔI₀, ΔS₀): 熱力学・絶対反応速度論の基本則応用
圧力: 標準体積変化(Δ_V)と活性化体積(Δ_V^*)
溶媒誘電率・イオン強度・静電気理論: 反応に伴う静電気的変化(電荷分布状態変化等)
pH: 反応に関与する活性解離基のpK値とその解離熱 (pK値への温度効果より)
解離基の種類とその役割: [H⁺]含む速度式の解析

基質及びエフェクターの構造: 基質やエフェクターと酵素の結合性質、酵素活性部位構造等。分子構造と親和力との関係の系統的考察

阻害部分: ① 酵素触媒の機構・経路、② 酵素基質特異性、③ 活性部位官機能の性質、④ 酵素、分子の特異なコンフォメーションの維持に関与する特定の官能基の性質、等

可逆阻害 reversible inhibition

拮抗阻害 (競合阻害, 競争阻害) competitive inhibition

V_maxに達する時間延びる ⇒ V_max値に影響ないがK_M値が変わる

コハク酸succinateが脱水素を受けフマレートfumarateに変わるときにフマール酸を混入するとコハク酸の脱水素反応がにぶる
COOH-(CH₂)-(CH₂)-COOH (Succinate) + Acceptor (succinate dehydrogenase)
→ COOH-CH=CH-COOH (Fumarate) + H₂ + Reduced acceptor
COOH-CH-COOH フマール酸 (この場合阻害剤, I)が入ると

____k₊₁
E + I ⇄ EI ∴ K_i = [E][I]/[EI]
____k_-1

化膿菌増殖に必要なパラアミノ安息香酸類似物質で拮抗阻害物質として効果 – 助酵素結合部に構造の良く似たスルフォンアミドが結合し酵素作用がなくなる
V_i = V_max/{K_M[I]/K_i]} 阻害剤のあるときのK_M


☛ エチレン vs CO₂

非拮抗阻害 noncompetitive inhibition

Ag⁺, Hg⁺による阻害
E-SH + Ag⁺ ⇔ E-S-Ag + H⁺ (酵素活性失われる活性部位とは無関係)
E + S ⇔ ES ⇔ E + P
E + I ⇔ EI
ES + I ⇔ ESI … K_i
1/v_i = (K_M/V_max·1/[S]·1/V_max)(1 + I/K_i)

基質-酵素複合体がさらに基質と結合し不活性化 - 高基質濃度が逆に阻害効果をもたらす

阻害剤が基質-酵素複合体にのみ結合

非可逆阻害 irreversible inhibition

ICH₂CONH₂
E-SH
E-SH + ICH₂CONH₂ → E-S-CH₂CONH + HI

E: enzyme (E-CH₂-OH)

調節酵素 control enzyme or regulatory enzyme

アロステリック酵素 allosteric enzyme

⇒ CTPは基質と独立に異なった部位に酵素と結合して構造に変化をおよぼし酵素作用を低めたと考えた

上記(1)-(3)のうち(1)(3)、特に(3)の定義に対応する酵素をアロステリック酵素と呼ぶことが多い。→ 最終産物に阻害される酵素

(Asp + carbamylphosphate → carbamyl aspartate)
                        Asp ↴┏ATPase┓
carbanylphosphate →→→→→→ ureidosuccinate →→···
       ┏━━> 活性化▲   ↑▲阻害
    ATP          ···→→→ CTP →→→ dCTP - DNA - d…

┗ RNA ━━━ [核酸前駆体]

v = V_max[S]ⁿ/K_M[S]ⁿ (n = 1のときミカエリス=メンテン式成立)
v/(V_max – v) = [S]ⁿ/K_Mⁿ
logv/(v_max - v) = n·log[S] - ⁿ·logK_M

v v_max 0.1 S_0.1
v v_max 0.9 S_0.9
v/v_max = [S]ⁿ/kMⁿ
ここでv = 0.1, v = 0.9
n = 1, 2, … → [S]ⁿ = K_Mⁿ·v/(M_max – v)
[S_0.1]¹ = 0.1 K_M/0.9, [S_0.9]¹ = 0.9 K_M/0.1
n = 1 → [S_0.9]/[S_0.1] = 81, n = 2 → [S_0.9]²/[S_0.1]² = 9

共有結合性変調酵素 co-varientry modulated enzyme

______→k₁→___________K_i_________K_i
E + S ] ←k_-1← [E + p, E + I ↔ EI, ES + I ↔ ESI_Ki[EST]

E: enzyme, S: substrate, I: inhibitor, k: rate constant, K: equilibrium constant

[ 消化器系 ]

消化酵素 digestive enzyme

炭水化物

アミラーゼ amylase: 可溶性デンプン、グリコゲン等、一般にα-1,4-グルカンに作用し、α-1,4-グリコシド結合を加水分解する。最終産物はマルトース・グルコース

α-amylase = 動・植物、細菌    β-amylase = 植物、細菌

脂肪 (lipid)

タンパク質 (protein)

ペプトン peptone: 主にペプシンや酸の働きで，タンパク質がアミノ酸になる途中まで分解されたもの

水・酸・アルカリに可溶
ペプトンが腸液に含まれるエレプシンによりアミノ酸に分解される

ペプシン、トリプシン、キモトリプシン等 -各々が特定アミノ酸結合を切る
分泌される時は不活性(酵素作用がない)な形で、後に活性化される
→ 自身のタンパク質は分解せず養分として取りこんだタンパク質のみを分解するのに適した性質(この働きが崩れると十二指腸潰瘍になる)

ペプシノーゲン → HCl、既にあるペプシン → ペプシン
トリプシノーゲン → エンテロキナーゼ、既にあるトリプシン → トリプシン
キモトリプシノーゲン → キモトリプシン

加水分解酵素

酸化還元酵素

チトクロームに伝達されたHをOと結合

その他

制限酵素 restriction enzyme, REase

Eco RI  -G          ↓AATTC-    λファージ 5ヵ所、SV40 DNA 1ヵ所
             -CTTAA ↑G-
Hind III   -A          ↓AGCTT-    λファージ、SV40 DNA 共に6ヵ所
             -TTCGA ↑A-
⇒ 十字形構造(ヘアピン構造) - 回文

DNAリガーゼ (DNA連結酵素, DNA ligase or DNA joining enzyme)

2本鎖DNAの片方の鎖の切断部(隣接する3'-ヒドロキシ基と5'-リン酸基)をホスホジエステル結合させる
Mg²⁺要求 + ATP(ファージ)/NAD(細菌)

制限酵素 + 連結酵素 → 組換DNA

実験 (experiment): 酵素反応(唾液アミラーゼの作用)

方法 (methods)

1. 唾液を試験管に取る(口を濯いでおく)
2. 唾液1 mlを三角フラスコにとり0.1 M NaClで100倍希釈(= 1%酵素液)
3. 2倍希釈法で1%, 0.5%, 0.25%, 0.125%, 0.0625%の酵素液を作成
4. 試験管を金属製試験管立てに並べ、酵素液以外の反応液(基質液、緩衝液、0.1 M NaCl液)を入れる
5. 試験管立て全体を30°Cの恒温水槽に入れ、約5分間放置する
6. 試験管に酵素液を加えよく攪拌する=反応開始(短時間内に液が十分混ざり合うよう試験管を急激に振る)
7. 10分後に、各試験管に5 mlの1 M酢酸溶液を加え、よく攪拌する=反応停止(液量が多くなっているので、以前よりも混ざりにくい。又、短時間内に反応を停止させないと実験誤差の原因ともなる)
8. 同数の試験管を別に用意して、各々に10 mlのヨウ素液を入れておく
9. 停止反応液から1 mlづつ取り、ヨウ素液の中に入れ、良く攪拌 = 発色
10. 分光光度計で波長680 nmの吸光度を測定する
11. 酵素液無添加の試料(= デンプンは全く消化されない)の吸光度をD0とし、次の式から各々の試料(吸光度D)の酵素活性を計算する
    酵素活性: 酵素1 ml当りが分解した基質量 = 10 × (D0 - D)/D (mg)
12. 表・グラフを作成

デンプン アミロース アミロペクチン 限界デキストリン グリコーゲン
青藍色_青色_____赤色________赤-褐色________褐色

酵素濃度と酵素活性

                     Blank                   D₀
試験管番号         1  2  3  4  5  6  7
基質液                    2  2  2  2  2  2
pH 7.0緩衝液      1  1  1  1  1  1  1
0.1 M NaCl溶液   2                     1
酵素液 1%           1  1
            0.5%               1
            0.25%                 1
            0.125%                   1
            0.0625%                     1    
計                        4  4  4  4  4  4  4

酵素反応とpH (最適pHを求める)

実験結果: 表及びグラフを書く

注: aのような曲線は濃度が高すぎる
ので酵素液を薄め再実験。Cは諦め
るしかない

酵素の熱失活

1. oxidoreductases (酸化還元酵素)

ニトロゲナーゼ2量体(活性中心) + ニトロゲナーゼ還元酵素

遺伝子

2. transferases (転移酵素)

= アミノトランスフェラーゼ aminotransferase = アミノ基転移酵素

3. hydrolases (加水分解酵素)

4. lyases (分解)

5. isomerases (異化性酵素)

6. lygases or synthetases (合成酵素)