ミトコンドリア内エネルギー生産
細胞内小器官 (オルガネラ)
→ 分化 differentiation. Ex. conpartmentation, 構造・物質等

細菌類、藍藻類 = monocellular
Escherichia coli: 2-3 μm l × 1 μm w

glucose, (NH₄)₂SO₄, P, S, Mg → 1回分裂に50分毎
glucose, 有機N化合物(アミノ酸・ペプトン・肉汁, P, S, Mg → 1回分裂に20分毎

1) 大腸菌にinsulinを作らせる
2) 大腸菌にcellulaseを作らせる
ブドウ糖glucoseを作れないがその他の存在に必要な物質は全て作れる → その最小サイズが大腸菌

                                       
大きさ(径) (μm)
有糸分裂
核膜(膜を取り囲む構造)
小胞体
ゴルジ体
細胞器官
液腔
リボゾーム
呼吸酵素系
光合成系
鞭毛
原形質流動
性現象
N₂(分子状窒素)固定反応
化学合成**                      

原核細胞                      
1-数
無
無
無
無
無
稀
70S
細胞膜内局在
細胞膜内局在
線毛(ビリー), 細菌鞭毛
無
稀, 不完全
一部の種
一部の種                      

真核細胞                 
> 10
有
有
発達
発達
発達
普通
80S*
ミトコンドリア内局在
葉緑体局在
(9+2)微小管 + 外膜
一部のもの
普通, 完全
無
未詳                        

細胞内膜系

細胞基質 cytoplasmic matrix

後形質 metaplasm

+ それに基づく構造 Ex. 細胞液、澱粉粒・卵黄粒・脂肪粒・種々結晶体・色素・乳液

細胞器官

細胞含有物 Ex.

特性             細菌               古細菌           真核生物

膜に囲まれた核   なし               なし             あり
細胞壁           ムラミン酸含       ムラミン酸含まず ムラミン酸含まず
膜脂質           エステル結合       エーテル結合     エステル結合
リボゾーム       70S                70S              80S (細胞質内)
開始tRNA         ホルミルメチオニン メチオニン       メチオニン
tRNA遺伝子中     稀                 あり             あり
  のイントロン   
RNAポリメラーゼ  1(4SU)             複数(各8-12SU)   3(各12-14SU)
ジフテリア毒素   なし               あり             あり
  感受性         
CP/SM/KM感受性   あり               なし             なし (細胞質)

SU: サブユニット。CP: クロラムフェニコール、SM: ステレプトマイシン、KM: カナマイシン

機能 function

Ex. 真正粘菌 → 不定形 amorpha: 体制とは関係ない
Ex. 多細胞の個体が体制を成す
硬い細胞の方がしっかりする: 水を吸うと細胞が固くなる → 細胞壁必要

機械組織 mechanical tissue: 骨格として働く Ex. 膜組織、角組織

構造 structure

仮導管 tracheid・導管 vessel: 3層二次壁が発達したもの → 柔組織細胞 parenchyma: 二次壁がない
外層(S₁), 中層(S₂), 内層(S₃)

リグニン = 木化
スベリン = コルク化
クチン質 = クチクラ化(植物のクチン質はロウに似た物質)
クチクラ: 体表を覆う細胞が外表面に様々な物質を分泌し形成する膜状構造

主成分: リグニンlignin → 木(質)化(肥大化) lignification = リグニン蓄積によりsecondary wallを形成
細胞成長に伴い液胞が徐々に広がる一方で木化進む。環状、螺旋状のものがある。一種の生物中にこの2つの状態のものが混じり存在することもある

成分

表. 一次細胞壁の構成成分比(子葉鞘、幼茎、葉等の平均的な値) (Setterfield & Bayley 1958)

成分_______ヘミセルロース ペクチン物質 セルロース タンパク質 脂質
乾燥重量比(%)__50-55_______5________25-35___2.5-5____7

Sucrose-6P + H2O → Sucrose + Pi: sucrose-phosphatase (EC 3.1.3.24)

α-1,6 α-1,6 α-1,6: 結合するときはQ酵素を用いる
グリコーゲンglycogenなどは枝が短いが数が多い

酵素活性 enzymatic activity

pectin methyl esterase-1,3-glucanase

セルロース中から特殊なアミノ酸を抽出 → 細胞壁の分化に関与すると考えた
Acer pseudoplatanus, Lycopersicon esculentum
細胞壁から糖タンパク質 glycoprotein 抽出 = extensin (細胞壁拡張 extension関与タンパク質と命名)
S-S結合

_Arb___Gal Hydro Serine (Lysine, Xyrosin, Valine, Threione)
14-16__2-6_9-10___3______________1-数

動物: 電子顕微鏡でやっと観察できる
植物: 大型で老細胞では大部分が液胞となる

機能

• 細胞質必要養分貯蔵 = 炭水化物・タンパク質・有機酸・無機塩類・アントシアン・タンニン等含む
• 細胞内pHを酸性に維持
• 形態保持: 膨圧維持、水分保持

この場合tonoplastとplasma membraneは同じもの

液胞膜と構造的に似る

流動モザイク説 (fluid mosaic theory)

極性 polarity を調べるのに赤血球を使う利点: 細胞壁、核がなく膜だけの構造をとり観察し易い。これを低張液(0.14 M, NaCl)につけ溶血ghostさせる(等張ではvesicleができ、低張ではinside-outになってしまう)

機能 function

1) 細胞内環境維持

TMVより原形質体protoplast抽出
→ protoplastではウイルス感染は数10倍高まる

2) 物質透過・輸送

物質: 分子量 濃度 蔗糖:_342 内 < 外
尿素:__60 内 < 外 → 5-10 Å(尿素が出入りするpore size)
水:____18 内 > 外

蔗糖では永久に原形質分離plasmolysis状態であるが、尿素では時が経つと内外部とも濃度が等しくなる(原形質分離が見られなくなる) → 形質膜にはある大きさ(尿素)を通す程度の孔がある

→ エネルギーを得るにはATPとATPaseが必要
ATP adenosin triphosphate (A-T-P~P~P)
ADP adenosin diphosphate
AMP adenosin monophosphate

選択的透過性 selective permeability

Ex. 柔突起養分吸収、根毛高濃度養分吸収、Naポンプ

赤血球 27.4 K⁺: 細胞内 > 外: 血漿 5 mM
赤血球 0.16 Na⁺: 細胞内 < 外: 血漿 145 mM
外向 efflux (outflux) 0.15 μmol/cm², 内向 influx

3) 情報伝達

H₂O, O₂, CO₂
> C₆H₁₂O₆, amino acids, fatty acids > glucan, etc.
> 多糖類, protein, fat

脂質: 脂肪酸グリセリド(fatty acid glycerides, 脂肪酸とグリセリンの化合物)。C₁₇, C₁₉類が多い

食胞 food vacuole (食細胞 phagocyte)

他種細胞を取り込む ☛ 細胞内共生

取込過程

排出過程
排出過程は取込過程の逆を想定すれば良い → 使われる器官は exocytosis
※この際、この作用が行われるのはある程度特有の細胞である

細胞基質 cytoplasmic matrix

細胞の相互認識

→ 培養層内でお互いを認識し同種細胞が集まり結合

→ この部分をぺプトン等で分離すると異種タンパク質も結合

生体内脂質

______________血漿_____牛乳
リン脂質_______8-25%___半分
コレステロール__10-27%__殆どなし
トリグリセリド___< 10%____1/3

エネルギーの貯蔵物質として脂質は高エネルギー分子なので適している
脂質はエネルギーを運搬している。例えば、血液中を脂質はそのままの形で運ばれている

神経細胞末端と筋肉細胞はneuro-mascular junctionという形で結ばれる
_____________Na⁺_____K⁺_____Ca⁺⁺_____Mg⁺⁺
内側(筋肉)___15 mM 140 mM____10 M____数 dmM
外側(血液)__140 mM__4.5 mM__<< 数mM___>>
glucose, glucophosphateの透過性は高い
cAMP: 情報・刺激 → Ca: 一次伝達・二次伝達

1. 形態保持: 膜の表面積を広げるため内側に膜が侵入する
2. 物質の取入排出(必要物質吸収・不溶物排出)
3. 浸透圧調節

粗面小胞体 rough-surfaced endoplasmic reticulum, rER

Golgi apparatusはそのままGoldi bodyになることもあればlysosomeとなることもある

滑面小胞体

Ex. 脂質合成酵素により脂質を合成し、流動モザイク構造に脂質を渡す

ミクロボディ microbody

中心体 centrosome (中心粒 centriole)

鞭毛 flagellum

鞭毛の種類

鞭毛糸: 9 + 2 = 11

構造 structure

ゴルジ膜: 偏平な嚢
ゴルジ顆粒 Golgi vesicle: 小球状の小胞
ゴルジ液胞 Golgi vacuole: 大型の液胞

機能 function

リソソーム(リソゾーム) lysosome

植物: 液胞がこの機能をもつ(リソソームがないわけではない)

主要機能

自信が複製・転写・翻訳の独立した機能を持つ
動物: external NADHはmt膜に対して非透過性
植物: external NADH (シャトル機構 shuttle mechanism)

ATP, ADP: アトラクチロシド (atractyloside)により阻害受ける
リンゴ酸塩 malate, コハク酸エステル succinate: マレイン酸水素n-ブチル n-butyl maleateによって阻害を受ける
アミノ酸 amino acids

構造

→ 周囲の細胞質より屈折率高い → 生細胞でも位相差顕微鏡で観察可
染色固定には四酸化スミソニウム固定や過マンガン酸カリ固定用いる

膜間層
外室 outer chamber

mt-DNA: 核DNAと分子の性質が異なる
mtリボゾーム(mitochondrial ribosome) = mt特有のnuclein - ribose: だるま状
= 前核細胞ribosome = 細菌型ribosome(70S小) - 細胞質ribosome 80S

二重膜

mt膜分子模型
(Sjöstrand 1960)

膜が2枚集まった2重膜であることを発見
脂質2分子は2層のタンパク質膜(単位膜)が2枚密着して、mtの二重膜構造を形づくっている。その膜の両側にさらに球状タンパク質が並んでいる(モデルの膜の厚さは後に修正)

calf heart mascleを低張中で重金属によるnegative stainingする
繰返(基本粒子) - repeating unit theory
頭部がelectron transport systemに関与していることが考えられる(elementary particles, EP)。実際にはATPaseが存在していた。EPは内膜粒(F1-particle)と後に名称が変わる

mt全重量に対する割合 = タンパク質・脂質・他 (50) + 水 (50)

mt全乾燥重量に対する割合 = タンパク質 (70) + 脂質 (25-30) + 他 (≤ 数%)

全タンパク質に対する割合 = 可溶性タンパク質 (20) + 不溶性タンパク質 (80)

脂質に対する割合 = リン脂質(不溶性タンパク質と結合) (≥ 90%)

不溶性タンパク質 = 構造タンパク質 + 電子伝達系タンパク質

a. 1ミトコンドリアあたり平均長、または数(過マンガン酸カリ標本)
b. ミトコンドリアのタンパク質重量 (1 gあたりのμモル数)

機能

C₆H₁₂O₆ + O₂ → 12H₂O + 6CO₂ + 38ATP (688 kcal)

ミトコンドリアは水吸収・排出(ATPも一緒に出入)により収縮膨張を繰返す
酵素はmitochondria表面に集まり易い

現在否定
コハク酸 (succinic acid): HOOC-CH₂-CH₂-COOH
リンゴ酸 (malic acid): HOOC-CH₂-CH(OH)-COOH
フマル酸 (fumaric acid): HOOC-CH=CH-COOH
オキザロ酢酸 (oxaloacetate): HOOC-CH₂-CO-COOH
すり潰した組織の中でO₂消費が行われるにはジカルボン酸必要と考える

クエン酸 (citric acid) → トリカルボン酸 (tricarbonic acids)の重要性 - 酸素消費のために重要
無機リン酸 - 減少
glucose-6-phosphate, fructose-6-phosphate増加

→ 無機リン酸は増加物質の複合体となると考えた

シアン化合物を加えると活動鈍る

→ シアン化合物はO₂阻害を行うためO₂の必要性が示唆された

→ ATP生成にO₂必要: ADP + Pi → ATP

homoganated cells: 呼吸の活発な遠心分離部に酸化的リン酸化(oxydative phosphorylation)の中心組織を見出しcyclophoraseと名付けた → cyclophorase system

NADの還元により紫外線吸収波長変わる
FAD (flavine adenine dinucleotide)
サイトクローム (cytochromes)
ヘム鉄: ヘムタンパク → Fe²⁺ ⇔ Fe³⁺
5種のチトクロームの系がある: b, c₁, c, a, a₃
種により紫外線吸収に特徴がある

TCA回路

              オキザロ酢酸 →  クエン酸
イソクエンサン ↘↙NADP⁺           ↘↙ NAD⁺
 オキザロ酢酸 ↙↘NADPH + H⁺  ↙↘ NADH + H⁺
ATPができるところ = F1 particles, 助酵素のあるところ = rc particles

小胞 vesicles

M right-side-in right-side-out e^- 2分画に分かれたとき coupling factorで再構成

人工的にmitochondriaをばらす－亜mitochondria(vesicle)粒子化
普通抽出すると外側の膜が外側になってright-side-in得られるが、一部膜が逆転してright-side-outが得られる
酸化的リン酸化(反応) oxidative phosphorylation

トリプシン trypsine, 尿素 ureaで分解ののちに遠心分離
↓ 内膜粒を失った亜ミトコンドリア
沈殿・上澄の2分画が得られる

沈殿: 電子輸送行うががADPリン酸化できない分画(電子伝達系)
上澄: ATPを加水分解するが電子輸送できない可溶性F₁ ATPase (F₁ particle → F₁ ATPase)分子のある分画
∴ 基本粒子(elementary particles, EP) = ATPase

色素体 plastid

褐色体(褐藻・珪藻) phaeoplast → 褐藻素 fucoxanthin
紅色体 rhodoplast → 紅色素 phycoerythrin

光合成色素

a (青緑): 435, 670-680 (生体内)
b (黄緑): 480, 650 (生体内)
c: 645 (生体内)
d: 740 (生体内)

α-カロチン: 420, 440, 470 (ヘキサン中)
β-カロチン: 425, 450, 480 (ヘキサン中)

ルテイン: 425, 445, 475 (エタノール中)
フコキサンチン: 425, 450, 475 (ヘキサン中)

フィコエリトリン: 490, 546, 576 (蒸留水・生体内)
フィコシアニン: 618 (蒸留水・生体内)
アロフィコシアニン: 654 (リン酸緩衝液・生体内)

[ 葉緑素抽出 ]

葉緑素(クロロフィル) chlorophyll, chl

                  ピロール核  中央元素  フィトール基
    クロロフィル       4          Mg          有
    ヘモグロビン       4          Fe          無 

Rx:
Chl a: -CH₃
Chl b: -CH=O フィトール側鎖 (親脂質性)

*: 3: CH₃がCHOに置換。4は上と同

構造

原核生物 (prokaryote)

H2S - bacterio chlorophyll

真核生物 (eukaryote)

グラナ granum (pl. -a): 葉緑体内でチラコイドが層状に並んだ部分

→ 光合成(明反応)を受ける色素局在

EM観察

組成: RNA 60%, protein 40%の種多

____小亜粒子 small subunit_
____大亜粒子 large subunit____

細菌型と真核細胞型

S = 70   直径 = 140-210Å   2.7 × 10⁶ (RNA = 65%, protein = 35%)

* 順序良く結合
S値: 大亜粒子 + 小亜粒子 > 全体 → 結合の際に立体構造が変化し沈降速度が変化するため

再構成 (E. coli)

再構成: 16S RNAとS1-S21を精製し再構成順序を明らかにする

Ex. 16S → S4/S8 → S7 → S19/S9 → S14 → S10 → S3

機能: S12: 誤訳(曖昧)因子。不在時に正しい翻訳, S11: 正訳因子。S6, S15, S18も関与, S7: 調節因子, S13: m-RNA結合

再構成: 23S RNA + L1-L34 + 5S RNA → 50S
機能: L18, L25: 5S RNA結合, L2, L27: P-site, L7: 翻訳行為, L1, L16: A-site

ポリゾーム polysome or polyribosome

1アミノ酸生成に3塩基配列必要 → 141 × 3 = 423個の塩基からなるm-RNAが最低でも必要
ヘモグロビンα鎖を作るには6-7個のribosomeからなるpolysomeが必要

無核細胞もある Ex. 赤血球
赤芽球: 哺乳類赤血球細胞はでき始めの頃は核がある - 成熟に伴い核は細胞外に出て無核細胞となる

核膜 nuclear membrane

仁 (核小体) nucleolus, pl. nucleoli

Allium cepa (タマネギ): 1仁/1細胞
Vicia fava (ソラマメ): 2仁/1細胞被膜なし(EM観察の限り仁-核液間に明白な境界ない)

amino acidのままなら沈殿しない
proteinは沈殿
90°CでRNA, DNAは分解 →

acid insoluble fraction → protein合成は行われた

Pronin (RNAを染める) → nucleolusがpink / Methylgreen (DNAを染める) → 核質がvioletと染め分けできる
核小体にRNAがあるから染まる → このRNAはr-RNA (precusor-r-RNA) → ribosome合成の場

成分

condensed chromatinをnucleolus associated chromainと命名

ヒトデ卵細胞を低張液に浸し加圧し核を取出し、更に遠心で核小体を取出す(但し低張液だと水に溶け出すので分画法発達すると等張にする) →
RNA = 3-5%, proteins = 85-95%, DNA = 0 (最近のデータは0.2-10%)

核DNAと核小体を囲むDNA(G, C rich)では組成が異なる
核小体付着DNAはr-RNAのgeneである
----------------------------------- DNA__DNA/RNA hybrid
-------UUGGCCG------------- RNA
____gene coding sequence__⇓
___________________produce H³-rRNA
→ 核小体がr-RNAを作る場というのは過ちではない

DNA/RNA hybridを作ると、このDNAは外のDNAとつかず核小体のDNAのみにつく
→ これはr-RNA gene、即ちcoding sequenceである
∴ 核小体についているchromatinはr-RNA gene cistron

*: attached labeled RNA:
radioautographyにかけて
現像するとある所は
silver gray

→ r-RNA geneの存在箇所を確認

核質 nuclear substances

0.25 Mショ糖に浮遊させ音波処理 = 核破砕 → 遠心, 2500 × g, 8 min. → 沈殿 [上澄 (染色質、核液)] → 0.88 M ショ糖に浮遊 → 遠心 → [上澄] → 上の処理をもう一度繰返す → 最終の沈殿 = 核小体

ヒストン histone

クロマチン: 分散状態 - 休止核
染色体:___凝集状態 - 分裂核

クロマチン/染色糸/染色質 (chromatin)

異常凝集部heteropycnosis発見: heteropycnosis数 = chromosome数 → pro-chromosomeと考える

Feulgen staining (for specific DNA) was made after Trillium is chilled at 0-4°C for 4 days
→ find out nucleolous associated substances = GC rich DNA (H-segment) → gene for RNA (= rDNA)
普通なら染色されるのだが低温処理すると染色されない(=hetero chromatin, H-segment)所がある

*: これをHeitzの結果はdilutionしている

HCl or NaOH, NaCl, 60-65°C処理で染色体は殆どstainしない
Gimsa staining (Pardue & Gall): 核 → 紫
C-band = 一部染色された部分 - euchromatinにはない

異質クロマチン condensed chromatin (heterochromatin): 分裂期間中も見え続ける凝縮部位 heteropycrosis

このDNAがRNAに転写されないため遺伝的不活性染色体上でhetero-chromatinになる部位は決まっている。Heterochromainはminor chromatinでありアミノ酸情報には関与しない

真性クロマチン diffused chromatin (euchromatin): 分裂時に見えなくなる解けたクロマチン。遺伝的活性部分
Möller strand
染色分体chromatid: 0.5-2 μm → 4(8)本
Half-chromatid 0.1-0.3 μm → 2(4)本
Half-half chromatid: 500-600Å → solenoidが1本ならd. st.は1本、2本なら2本

ヌクレオゾーム nucleosome

2分子のH₂a, H₂b, H₃, H₄を含む (1 × H₁も含む)
H₃, H₄はplant histone, animal histone共通 → 進化過程で変化がない

直径 = DNA直径 × 7, 太さ = 1/7

ソレノイド solenoid : chromatin (nucleosome)が螺旋状となる
スーパーソレノイド super-solenoid: 更に染色体化した時の構造

↔ ヌクレオソーム (100 Å) ↔ DNA 2重螺旋

核液 nuclear sap or karyolymoph

soluble protein (free enzyme), nucleoside, ヌクレオチド分解酵素nucleotide
RNA-proteins
DNA-protein chromatin

核からRNA + proteins, rDNA (r-RNA gene DNA) + proteinsを取り除くとprotein netが残る
Protein net = nuclear skeleton (network skeleton)
→ function: DNA複製 replication, transcription = DNA複製に関与

核の糸 (thead)

海面展開法: ミツバチの胚 (chromatin, chromosome)

→ Trypsin処理 → 23-26Å ∴ コイルしている所が230-250Å。伸びている1本は23-26Å

この球状物質: 命名v-body, chromatin-body等 → nucleosomeに統一

Chromain + DNase II (staphylococccal nuclease) → DNA extract → analysis/results
除蛋白質 by gel electrophoresis
ある間隔でDNaseからprotectする部分がある。この残る最小単位が200 base pairs。酵素量 増加あるいは反応時間を延長すると200 b.p.が増え、2 × 200, 3 × 200, 4 × 200が減少する。

(Brachet & Lang 1965)

再生 (regeneration)

移植

1) Carnoy's fluid (for fixation) + Azorcarmine (for staining)

growth point → stainingに差

2) Azur I (for staining RNA) → 1)と同じ結果を示す → RNase処理にsensitive → RNAもある
→ タンパク質とRNAの複合体が形態形成物質

光により形態形成が影響される (遠心をかけると成長点が変わる)

即ち、リボゾームにm-RNAが付いた状態で染色している

                                        G     C     W
        1次元                         13.5   7.2  12.3
        2次元                         12.9  10.5   9.2
        8 azagnanine (RNA inhibitor)  13.5   8.2  12.0

Base ratioに変化が起こる: RNA inhibitorを入れると変化が起こっていない(現在データは否定的だが、考察は正しいと考えられる不思議な結果)

2, 4 cells → actynomycin処理(RNA合成阻害剤) → 2次元成長止まるが1次元成長進む

Fucusで³H-uridineを取りこませ追跡すると同様の結果を得、中沢の実験追証
RNA religionは染色およびラジオオートグラフィーによって証明された
しかしRNAはpolysome上にある可能性が高く、そうであればm-RNAの動きを追跡しているともとれる
m-RNA conditions: protein complex, stable m-RNA (long-lined m-RNA)がみられる

集まらせる要因・RNAの正体・分化の"前触れ"現象

• s.s. 細胞分裂期に観察される棒状の構造体
• s.l. 真核細胞にあるゲノムDNAとタンパク質の巨大な複合体
• s.s.l. 細菌・古細菌・ミトコンドリア等細胞小器官が持つゲノム含める(ウイルスゲノムも染色体)

ショウジョウバエ唾腺染色体観察

Observation of salivary gland chromosomes in Drosophila

目的

材料 (特徴)

方法

1. スライドグラス上に3齢幼虫取り、生理食塩水を1滴たらす
   蛹化のためガラス壁に昇るが蛹化直前の幼虫唾腺染色体は観察しづらいので、大きく動きの良い柔らかな幼虫探す
2. 実体解剖顕微鏡下で2本の有柄針を使用し、唾腺を取り出す

   
   普通の体細胞染
   色体 (n = 12)

   1. 第1節目と第4節目に針をさし、右に引き裂く
   2. 内蔵露出、唾腺を確認
   3. 唾腺以外の組織除去(多少脂肪体は残っても良い)
3. 唾腺以外の組織を除去し1N HClを滴下、加水分解する(5-7分)、組織は白濁する
4. アセト・オルセインを滴下、固定染色する(10-15分)
5. カバーグラスをかけ低倍で観察(唾腺細胞の様子)
6. カバーグラス上に濾紙をのせ余分な染色液を吸い取り親指で押しつぶす 押しつぶす時にカバーグラスとスライドグラスがずれてはいけない
   押しつぶした後でカバーグラスをずらさないよう2-3回横にこすると良く広がった像を得る (何回かやってみる)
7. スライドグラスを低中倍で観察(良く広がった染色体探し全体像観察)
8. 高倍で詳細観察

唾腺胞染色体 (n = 6)
C: Chromatocenter

観察ポイント

1. 染色体腕arm本数
2. 染色体は濃染部bandと非染部interbandから成るがband数を数える (bandは機械的縞模様ではなく1本1本独特形態)
3. パフがあるか
4. 染色体欠損・転座・逆位等があるか

既成の永久プレパラート

ヒト染色体観察

1. 唾腺染色体との大きさ比較(巨大染色体で普通染色体の150倍以上)
2. ヒト染色体は正常で2n = 46(男 44 + XY、女 44 + XX) → 46本の染色体を確認できるか
3. プレパラートに44 + XXY、44 + XO染色体構成のものも入っている
4. 核型分析ができるか

材料

結果

1. 唾腺の全体像スケッチ(7 × 10)
2. ヒト白血球を培養したものによる永久プレパラートスケッチ

フローサイトメーターflow cytometer

非常に細い流液中に細胞等の微粒子を高速度で流し、これにレーザー光照射し、微粒子に当たって散乱する光や、予め蛍光物質標識した微粒子が発生する蛍光を測定する装置の総称

フローサイトメトリー flow cytometry

Flow karyotypingによる染色体異常解析や植物染色体解析等も試み
染色体解析/分取sortingをより速く人為的誤差を少なく行える

chloroplast DNA - turnover (代謝回転): 二本鎖環状double strand circle - 40 μm (5-6分子/chloroplast)
DNAaseで分解される → 葉緑体にもDNAがある

↓ 寄生説(mitochondriaもchloroplastもbacteriaだった)
chloroplastの起源origin: 現代的意味での共生説を始めて提唱

→ 葉緑体、ミトコンドリア共にDNA存在が確認された

プラスチド由来と細胞区画: ミトコンドリア等の系の通則
1. 単位膜にはプラズマ相と水性相がある。水性相は外界や細胞壁に接している相である
2. ミトコンドリアとプラスチドの膜は内外膜とも細胞膜起源であるが、外膜は宿主由来、内膜は寄生者由来

被核細胞生物成立以前の生物 好気性裸核微生物 = pro-mitochondria (self-genomeによる調節 = Emden-Myerhoff反応)
→ 共生

共生 = 被核性植物: protoplastidの取り込み(藍藻等にみられる)

  核                  裸核細胞  ミトコンドリア 被核細胞
    核膜                無        無             有
    2.5 nmフィブリル    有        有             (染色体)
    ヒストン            無        無             有
    染色体              無        無             有
    分裂装置            無        無             有
  電子伝達系の所在          細胞膜  内膜  (ミトコンドリア)
  タンパク質合成
    クロラムフェニコール阻害  有      有    無
    アクチノマイシン阻害      有      有    無
    RNase阻害                 有      無    無
    酸化的リン酸化依存        無      無    有
    可溶性分画の添加          不要    不要  必要
    アミノ酸のリポタンバク    有      有
    質の優先的取り込み

共生説(細胞共生進化説)

Ex. ゾウリムシ体内にクロレラの一種が共生
Ex. シロアリ腸内共生鞭毛虫、更にその鞭毛虫内共生する3種の細菌

共生説論拠

1. 共生者 = 元独立生物 → 自己増殖に必要最小限なものは固有に所持
   a) DNA
   b) mRNA
   c) タンパク質合成系
   d) ATPとその他のヌクレオチド供給源
   e) タンパク質とその合成素材となる低分子化合物
   f) 細胞膜合成系
   一部(大部分)を失うことはあるがsine qua nonとしてDNA, mRNA合成能力は失わない。また宿主と共生者のDNAは協調されねばならぬ。
2. 宿主細胞分裂の際、各々の娘細胞が共生者ゲノムの1コピーを最低でも受け取る系があれば共生の保証は高まる Ex. 共生者が多量に存在
3. 共生により形成されたオルガネラの代謝活性はまとまって一括して取りこまれる → 中途半端な経路はない
4. 逆に、共生者の喪失があれば、その失われた特徴は再び宿主に共生者が取りこまれない限り回復しない
5. 共生体それ自体の遺伝子を有するもので、宿主はその遺伝子に関してはメンデル分離を示さないこともある
6. 現世生物中にオルガネラに匹敵するものが生存していても不思議はない

マーグリス真核細胞共生説

RNA塩基配列: 担子菌類 ≈ 褐藻 ↔ 子嚢菌類 ≈ 紅藻

担子菌類との共通祖先から葉緑体を細胞内に取り込み褐藻分化
子嚢菌類との共通祖先から葉緑体を獲得し紅藻分化
→ 子嚢菌類と担子菌類は別祖先から進化してきた別系統菌類群
鞭毛菌類・接合菌類起源も子嚢菌類・担子菌類と別祖先由来の可能性
→ 菌類多系統説: RNA塩基組成による生物類縁関係と概ね一致

ミトコンドリアとバクテリア

1. 形と大きさの類似: 染色 = ヤヌスグリーンB、フェノール塩基性フクシンに良く染まる → 内部構造の共通点
2. ミトコンドリア内膜とバクテリアの細胞膜の類似
3. ミトコンドリアDNAとバクテリアDNAの類似
4. ミドコンドリアDNAは活性あるいは酵素タンパク質のアミノ酸配列を決めるヌクレオチド配列を持つ

1. コロニー – コロニー線
2. コロニーの機能分化
   a) タンバク質合成機構の集約
   b) 遺伝子支配の集約
3. コロニー数の間に伝達ネットワークができた

ミトコンドリアは多元か? – ミトコンドリアの不均一性

"Control of Organella Development" Symp Soc for Exp Biol London

現世藻類には葉緑素、葉緑体の構造で区別されるグループがある。それらは異なる光合成裸核生物を共生させた前被核生物の子孫である。また光合成裸核生物の大部分は死滅し藍藻だけが現存している
ミトコンドリア成立は被核生物成立最終段階 "This event brought to a close the purely cellular phase of evolution. Subsequently, the thrust of biological evolution received its primary expression at the organismal level."

現世共生生物

Ex. Convoluta roscoffensis (動物)にPlatymonas convolute (珪藻)が共生 ⇒ 珪藻は細胞壁、鞭毛、眼点を失い、体を指のように長く伸ばすようになる ⇒ 宿主との接触面積が増す

分類上の諸形質は共通性乏しが、これら3群はフィコビリンを有する
→ 光合成系に関する限り、互いに無関係に進化したとは考えにくい。紅藻とクリプト植物プラスチドは藍藻共生に起源したという仮説提唱(有力)。紅藻が裸核生物-被核生物中間とするのは根拠希薄という批判もある

I. 全器官、有機物、細胞内構造 –単系統的に考察したほうがよい?
II. 本質的でない構造の喪失を起こすには単一の遺伝子の突然変異だけで足りるが、ある構造の獲得には一般には多数の突然変異とかなりの時間的長さが与えられなければならない
III. 進化過程で表れた生物の大部分は死滅したはずであるのに提唱された系統上の仮定の生物と似た生物が実在するとすれば、その系統の信頼性は高くなる

グラム陰性菌 = 細胞壁薄い → 物質授受が用意(= 共生し易い)
グラム陽性菌 = 毒素生産 - 共生難しい

1. 架空生物を生命の起源に置くこと – Leeの場合にはクリプトチアノームを置いたが、これはRavenが緑色裸核生物、黄色裸核生物を起源においたのと大差はない
2. ピレノイドが藍藻の中央体由来はRavenの説でもLeeの説でも説明できる
3. Leeの進化原則IIに細胞壁は該当しない

Raff & MahlerとUzzell & Spolskyの論争

1. Proto-eukaryoteと目された生物が実は代謝的に大変原始的で非能率的である。当時、好気性エネルギー調達経路をもつ裸核生物があり、これらとの競争に不利であった
2. 共生者とProto-mitochondriaの一体化のためには共生者ゲノムから被核のゲノムへの遺伝子のまとまった移動が必要である。さらに被核生物、化石、生化学もこの考えを支持しない

前提: 好気的大気出現の後に被核生物が出現
被核生物には好気性のものは極めて少ない。広い目で見れば被核生物は嫌気的なところで生存するものもあるが、好気条件での代謝産物を利用しているにすぎず、嫌気的被核生物は存在しないともいえる
⇒ 被核生物 ≠ 単なる好気的オルガネラをもった嫌気的細胞質
現世の生物において細菌のチトクロームとミトコンドリアのチトクローム、またt-RNAの配列は大きく異なる
GC含量の特性、タンパク質合成系の相違

→ → →
細胞増大 ⇒_______陥入部が内膜から離れる__閉じて球胞となる
呼吸系(黒丸部)増大
= 陥入
→
呼吸オルガネラができる

この際、膜が閉じ酵素合成系の問題が生じる。そこでリボゾームおよび一部呼吸系のための遺伝子を持ったプラスミドをミトコンドリアに移した - 現実的ではない難題(目的論的)

3.7 Raff & Mahlerへの批判
5.4 "Origin of mitochondria" (180: 4085)

Saganの説は認めても良いが拘束力はない

__↓ 被核細胞の元となる裸核細胞
→ → →
_________ゲノム重複_ 細胞膜を陥入させ、__その後機能分化
_________起こす_____その際各ゲノムを___ が起こる
___________________一つずつ抱き込む

1. ミトコンドリア-バクテリア、葉緑体-藍藻の共通性は原始形質である
2. 真核生物が現世の好気性細菌、藍藻から派生するのは困難 → 好気性細菌と藍藻共通の祖先ancestor (progentior)から派生してきたとするのは信ずるに足る
3. 共生説で共生した細菌or藍藻が持ちこんだとする代謝装置を全て備えた原始被核生物は想定可能
4. 好気的細菌-藍藻共通祖先想定すれば真核生物の完全に信頼できる系統を描くことは可能
5. 現存プラスチドとミトコンドリアの構造は、進化のステップ毎により適応したと考えれば問題ない(目的論的)
6. 前真核生物protoeukaryotesは被膜性核膜形成のために表面を変形させる能力を持っていたはず。そうした変形は共生説に不可欠だが核膜形成と同様にミトコンドリアとプラスチド形成も容易にする(目的論的)

⇒ ミトコンドリア、プラスチドなく、cytosisで珪藻・遺体等を食べ生存。膜状ER、ゴルジ体なし。リボゾーム少

⇒ ミトコンドリアの起源?は被核細胞成立の最初の段階を"Pelonoya stage"と呼ぶ
P. p.には少なくとも2種の細菌が共生

1. 宿主-寄生者関係: P. palustris = 生涯同一細菌種共生。産地間で共生細菌種異なる(Jeon 1972)
2. 分裂の同調: 細菌は宿主の分裂の少し前に分裂する
3. 宿主の分裂と共生細菌の分配: 宿主は永久に共生菌を失わない。この現象はミトコンドリアに似ている
4. 核と共生細菌の絆: 細菌を包んでいる膜の単位膜と核膜の外膜はつながっていた。これはミトコンドリアに通ずるものではないか。また、クリスタ様のものが共生菌の大形な種で見られる

胞子はない。直径1 μm。土壌中好気性細菌
栄養適応度広く、酸素なければ硝酸呼吸行う – 酸素呼吸は硝酸の影響を受けないが硝酸呼吸は酸素があると停止。硝酸呼吸にはチトクロームc, dが合成され、他にハイドロゲノースhydrogenose(有機物ない時に生成)、蟻酸脱水素酵素、乳酸脱水素酵素等が誘導酵素として知られる

1. タンパク質/脂質比: 複膜構造系 mitochondria = タンパク質 内膜(細菌様) > 外膜(単位膜or細胞膜様)
   P. dentrificans: 単位膜あるいは細胞膜様 – 共生説に反する
2. リン脂質: P. dentrificansと細胞膜の組成は似ている
3. リポ酸 lipoic acids: ミトコンドリア脂質のリポ酸は全て直鎖型。細菌では分枝型のものもみられるが、P. dentrificansは直鎖型である。ミトコンドリアの直鎖型脂肪酸には飽和、不飽和型が見られるが、そのうち飽和型のものはステアリン酸(18:0)とパルミチン酸(16:0)でありP. dentrificansと一致する
4. P. dentrificansの呼吸鎖
   

NaR: 硝酸還元酵素、NiR: 亜硝酸還元酵素、NoR: 亜硝化窒素還元酵素
Z: 阻害反応、I, II, III: リン酸化位置
ミトコンドリアとP. dentrificansではtranshydrogenase, dehydrogenase, キノン, chytochrome oxydase, chytochrome b, c等の共通性が高い

共生系の進化 (Whatley et al. 1981)

発酵性原始被核生物が呼吸をする細菌を取りこみ相助生活を始めた。そればペロミクサ段階発酵の最終産物が共生した細菌の呼吸基質となる。その後、アデノシンヌクレオチドキャリアーを得て細菌のATP合成能が宿主に役に立つようになりミトコンドリアを持った被核生物となった

緑色ホヤ green acidian

1. 細胞壁は藍藻としては被膜を欠くが藍藻の形態は有している
2. チラコイドはクロマトプラズマ状であり裸核生物的
3. 細胞礎質に藍藻様のものがあるが、藍藻と異なり核領域ではなくクロマトプラズマ部分に見られる
4. 中央部は藍藻なら核領域であるが液胞様のものが見られる
5. 不明点が多いが総じて似る

☛ 昆虫|微生物|ウィルス

昆虫細胞内共生 intracellular symbiosis in insects

ホスト食性・栄養要求性 Ex. 肉食性のものは共生細菌少

菌細胞塊 mycetome: 菌細胞が集合した特殊器官

アブラムシ aphid

gap deletion: 28S rRNA分裂時に一部の塩基が消失すること

後口動物: なし
前口動物: あり (線虫, アブラムシ: なし)

単離共生体の³H-チミジン取込み阻害 = 共生体は原核細胞的