遺伝子 gene

(s.s.) タンパク質一次構造に対応する転写産物(mRNA)情報もつ核酸分子上特定領域(= 構造遺伝子, シストロン cistron)

塩基配列(DNA配列): DNAを構成する塩基(AGCT)の並び方

核酸研究 studies on nucleic acids

1869 ミーシェル: 膿(白血球死骸)から核細胞分離(命名ヌクレイン nuclein)

高P(リン)含有 = 強酸性で高粘性

red blood cell, yeast, yolk等から同物質取出す(他研究者達追試)
サケ白子(精子)からもnuclein発見

白子(精子)が含む塩基性タンパク質(プロタミン)がnucleinと結合していることを発見

→ 核酸は2種類ある

DNAは核内のみに存在 (→ 否定)

RNAがタンパク質合成に関与していることが強調される

→ 研究盛ん: ¹⁴CO₂, ¹⁴C-amino acids中から得られた
後に³²Pに移る

                                 RNA   DNA   Protein RNA/
                                 (%)   (%)    (%)    DNA
  細胞
    ハツカネズミ肝臓             4.8   1.3    93.9   3.7
    ハツカネズミ肝癌細胞         6.2   2.0    91.8   3.1
    タイコクネズミ肝臓           5.7   1.3    93.0   4.4
    ダイコクネズミ脾臓           5.2   5.2    89.6   1.0
    ニワトリ胚心臓               4.4   2.2    93.4   2.0
    モルモット脳                 2.8   1.2    96.0   2.3
    子ウシ胸腺                   -     -       -     0.4
    ヒト腎臓                     4.0   3.0    93.0   1.3
  核
    子ウシ胸腺                   1.7   26.5   71.8  0.06
    子ウシ肝臓                   1.5   15.6   82.9  0.10
    ニワトリ腎臓                 2.0   15.0   83.0  0.13
    ダイコクネズミ肝臓           4     17     79    0.24
    ダイコクネズミ腹水肝癌細胞   4.7   22.3   73.0  0.21
    モルモット肝臓               5     13     82    0.33
    エンドウ発芽幼胚             7     16     77    0.44

(核酸分析)

核酸構成成分と組成分析

核酸の化学修飾

1) 酸に弱い
2) dG: pH3で遊離, U: 1N HClでも安定

NMP: 比較的安定。NDP, NTP, cyclic NMP: 不安定, ATP ⇔ ADP + Pi

実験系

Ex. アミンbufferはアルキル化に、カルボン酸・リン酸bufferはエステル化に使えない

メチルメタンスルフォン酸、エチルメタンスルフォン酸などがよく使われる

(CH₃)₂SO_3'_______CH₃I 7' 中性________(CH₃)₂SO 3'_CH₂N₂ 3'
CH₃______1_______アルカリ 1'

U, C → [Br₂] → 5-Br^*
G, A → [Br₂] → 8-Br

CH₂=CH-CN, pH 11.5 - all reaction, pH 8.8 - none

(Canellakis et al. 1959)

ヌクレオチドのde novo生合成

G, Aのプリンがお互いを制御する
*: nucleoside diphosphate reductase
生体系中ではチミンは重要であるが、起源としてはウリジンがチミンに変わるのが一般的

³H-TdR → ³H-TMP変換の様子__Thumidine keinaseに制御される

Rat liver, hepatectomy: 肝臓一部切除し再生regeneration過程観察
再生のためのDNA合成: dGTP/dCTP/dATPでは再生せずdTTP必要

Vicia favaの発芽抑制機能 → 給水するとribonucleoside-S'-diphosphate reductaseを作る

肺炎双球菌
有膜型(S型, smooth colony)

多糖類の膜(白血球から体を保護する)
病原性あり。感染すると発病する

無膜型 (R型, rough colony)

病原性なし。感染しても発病しない

ネズミに

R型注射 → 発病せず
S型注射 → 発病死亡
(R型 + すり潰したS型菌)注射 → 発病死亡

死亡したネズミの体内にはS型菌が存在 → 形質転換

R型菌をS型菌に変化させたのは、すり潰したS型菌の何が加えられた時かを調べる
→ S型菌DNAが加えられたときにR型菌は形質転換
核酸(DNA)は比較的単純低分子物質 → 発表直後遺伝形質を担う物質がDNAととは認められなかった

遺伝子: 安定物質で種によりほぼ一定。体細胞には生殖細胞の2倍量
DNA: 細胞内で種ごとにほぼ一定。体細胞には生殖細胞の約2倍
タンパク質: 遺伝子に相応しい存在の仕方ではない

大腸に寄生するT₂ファージ: CHON(SP) – タンパク質、CHONP – 核酸

1. T₂ファージを放射性³²PO₄, ³⁵SO₄を含む培地で培養: ³²P → DNAに入る, ³⁵S → タンパク質に入る
2. 放射性元素を含まない培地で大腸菌に感染させる
3. 大腸菌中に入って新しいT₂ファージを作るのは³²Pを含んだDNAか³⁵Sを含んだタンパク質かを調べる

→ 大腸菌内に入りT₂ファージを作るのに働いたのはDNA

DNAのつなぎかえ

________________つなぎかえ
マウス胎児 ──▓▓▓───────▓▓▓───── not function
↓ 発育________V____ ⇓______C
成熟______────▓▓▓─▓▓▓───────── function
________________V____C
発育過程でDNAの繋ぎ替え(再配置)起こり細胞によりDNA配列異なる

高等生物遺伝子組換 (組替体 recombinant)

→ アルカリによるRNAの分解 → ___________
→ 逆転写酵素またはDNAポリメラーゼ → ‹==========
→ SIヌクレアーゼ → =============
→ ターミナルトランスフェラーゼ →
→ DNAポリメラーゼ, DNAリガーゼ →

→ これをホストのgenomeに乗せる: Interinjection →

細胞融合 (cell fusion)

エールリッヒ癌細胞にHVJウイルス(センダイウイルス)を働かせると細胞融合が起こる
現在ではポリエチレングリコールなどによっても異種細胞の融合ができることが知られ広く応用される

二重螺旋モデル
→ Franklin RがX線解析データを提供

DNA二重螺旋モデル double helix model

Cf. chloroplast DNA (organellaは寄生したprokaryote) → circle

extrachromosomal element: 核様体でない物質 cytoplasmic element: 核様体以外の部分にある物質

Viruent virus

Lysogenic virus

分子形態

1) 一本鎖DNA (single strand DNA)

(MW 1 × 10⁶ dalton, 5375 bases, 9 genes判明)

- replicationの際形成
M13, G4 phageはsingle strand

2) 二本鎖 double strand DNA (上記以外全て)

mitochondoria DNA, chloroplast DNA SV-40 DNA – virus DNAでありながらproteinと結合(nucleosome-like strand)

→ ligase (by リゾチーム)

Plasmid (E. coli)

→ 界面活性剤 → 遠心
→ DNAおよび3種のproteinと結合

相補的に"糊代"
的働きをする
= 粘着性末端
(cohesive end)

_____________________糊代部分

template phage, λ phase → 感染するとcircleになる
粘性が下がるにつれてcircle DNAが増す(Φ80, Φ82, Φ21によって調べられる)

Ex. T₄
→

________________切れて結びつく – 組換え重複する
________________exonuclease III – 末端重複 terminal redundancy

DNA一次構造決定法 (DNA primary structure - sequencing)

1) Sanger method (Sanger-Lovlson)

5' site: polynucleotidekinase [^γ32P]ATP
3' site: 末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼ [^α32P]dNTP

2) DNA polymerase利用

▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇
known_________unknown
▓▓▓▓▓▓ ---------------------------→
primer
dNTPの組成を変え転写状態を比較。NをG only, G + Tなどに変える

3) RNAに転写

───┬┬┬┬┬─────────── DNA
───┴┴┴┴┴─────────── RNA
_____primer_____後の手順は(1)と同様

4) Sanger-Loulson method (Sanger +,- method)

3' ───┬┬┬┬┬──────────────── 5'
5' ───┴┴┴┴┴───────────▶
dATP, dGTP, dCTP, [α-³²P]dTTP等のように1つをlabelingする
転写を様々なパターンで途中で止める
それを4種のdNAPのうち1つが欠けた系で複製させると様々なパターンの中からその反応を止めた長さの所の塩基がわかる。 Ex. -A系、+A系等で、同様に残り3種も行う。これら8種の系を電気泳動にかける

     ┣━┫  ┣━┫  ┣━┫  ┣━┫  ┃
     ┣━┫  ┃  ┣━╋━┫  ┃  ┣━┫
     ┃  ┃  ┣━┫  ┃  ┃  ┣━┫  ┃
     ┃  ┣━┫  ┃  ┃  ┣━┫  ┃  ┃
     ┃  ┃  ┃  ┃  ┃  ┃  ┃  ┃  ┃

1回に100-150 bases決定可能

5) Maxam-Gilbert method

アルカリ処理________ ↓______ ↓______ ↓

→ 塩基遊離 → (ヒドラジン ピリミジン切断) C, T破壊
→ 塩基遊離 → (ヒドラジン ピリミジン切断 / 塩高濃度) C破壊

a) 2つの遺伝子間にごく短い空間がある場合

        G遺伝子 ------->
        Pro Leu Lys End
     … CCA CTT AAG TGAGGTGATTT ATG TTT GGT GCT ATT …
           リボゾーム結合部位   Met Phe Gly Ala Ile
                                <---- H遺伝子 ---->

b) 2つの遺伝子がごく僅か重なっている場合

        ---------- C遺伝子 ---------->
        Pro Leu Ile Gly Lys Lys SerEnd
     … CCA CTA ATA GGT AAG AAA TCATGAGT CAA GTT ACT …
        リボゾーム結合部位      MetSer   Gln Val Thr
                                <--------------- D遺伝子

━▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇━
______ ↑AUG___________________________________↑UAA
▇ 構造遺伝子部分, ▇ 介在配列

DNA生合成

突然変異はmiscopyによるものであり、その発生率はその種の存続に関わる問題である
fidelity of DNA > fidelity of RNA

chromosomeが分かれている → linkage groupsを作る
Initiation of DNA replication in eukaryote: 複製単位は2n
Eukaryote cellは2n → nuclear membraneから始まるのではないか

DNA合成酵素 DNA polymerase

DNA修復 (DNA repair)

T–T: UVがあたると*部でT=T結合 (= thymine-dimer)
–T–S^*–P–S^*–P–S–
T=Tは複製を止めることができる ⇒ enzyme的機能 (光回復酵素)
除去修復 excision repair
--------------------- → --------------------- → ---------------------
-----〇〇___------___-----^〇_〇__-------___----- →→---------
endonuclease____exonuclease_______ligase
(切目を入れる)____(切り出す)
X-rayでdouble strandが切れた時にはこのような機構で修復される

色素性乾皮症 – この修復機構がないために起こる

DNA合成開始

E. coli cell cycle 80%が分裂
合成前にCMを加えると合成が続く。しかし、ずっとCMにつけておくと次の合成が始まらない
⇒ 合成開始と終わりにあるタンパク質合成が必要 = initiation protein

F-factorだけが複製できないことがあるのではないか
⇒ E. coliのlac geneをF-factorが取りこんだときにNTG処理

40°C → lac^-, 30°C → lac⁺

常温では○や○のみ複製してbのようなものが複製されない。つまり複製は別々に行なわれている

IG: initiation gene = 構造遺伝子replicon gene
R: replication site
→ replication gene (replicator)
I: initiation gene (initiator)

Replicon: 複製の最小単位(1つのIGを持つ) – IGを取り除くと複製できない(致死 lethal)

_______重金属で蒸着(リゾチームのSDSを使用)

測定長1400 nm (理論値1360 nm)。開く速度20-30 μm/sec

pea callus: 18 μm ↔ seedling roots: 38-42 μm (late S phase), 53 μm (early S phase)

Drosophila: cultured cell = 19 m / (somatic) = 9 μm → cell cycleの時間が異なることによるのか
egg (high DNA activity) = 2.6 μm: cultured cell S期 10 hr
egg. S期 3.7 min (initiation pointsが多数あればよい)
→ 可能性として、小さいreplication siteが多数ある → initiation site

今までは(b)をreplicon sizeとしていたが実際は○1つ1つが(a)ではないか

     H₂B          H₃        H₂A         H₁          H₄      
     ▇▇▇        ▇▇▇       ▇▇▇       ▇▇▇       ▇▇▇    
     <━━━━━━ 6500 kbp ━━━━━━>
サブユニット一つ一つが単位。従って6500/5 kbpが転写開始点

半保存的DNA複製 (semi-conservative DNA replication)

Hypotheses: 1) conservative, 2) semi-conservative, 3) dispersed

____________________conservative

Vicia faba root tip

1. E. coliを重窒素(¹⁵N)を含む培地でDNA塩基に¹⁵Nが十分入るまで培養
2. この¹⁵Nを含んだ大腸菌を¹⁴Nを含む(¹⁵Nはない)培地に移し適当な時間培養
3. 適当時間培養し、そのDNAを抽出し、これを塩化セシウムCsCl 溶液(6 mol 比重1.7 g/cm³)にいれ遠心分離にかける(density gradient centrifugation 密度勾配遠心法 density label)。すると、¹⁵N-DNA(¹⁵Nのみ)、¹⁵N¹⁴N-DNA(¹⁵N, ¹⁴N混合)、¹⁴N-DNA(¹⁴Nのみ)はそれぞれ自分と同じ密度のところに集まる

結果    DNA                       ¹⁴N           ¹⁵N                ¹⁴N¹⁵N
親(P)   ¹⁴Nのみ                                                         ████████
第2代  ¹⁵N¹⁴Nのみ                             ████████
第3代  ¹⁵N¹⁴N:¹⁴N = 1:1   ████       ████
第4代  ¹⁵N¹⁴N:¹⁴N = 1:3   ██████  ██
考察

⇒ ¹⁵N¹⁴Nが¹⁵NDNAと¹⁴NDNA鎖からなる証明
1) 2重鎖のDNAを100°Cで30分ほど処理し一重鎖に分離させる
2) この一重鎖を遠心分離で分けると明瞭な2本の帯に分かれる

共にDNA取り出しsemi-conservative replication指示

⇒ cellulose: タンパク質付着 - それを調べる
3.5 × 10⁴ daltonタンパク質(ssb91)発見
= ss DNAとよく結合 → ssをds化する?
ssb 91が異常だとds DNAが合成されない
super-coilしているものが複成のときに開く → neckを入れることも関与
enzyme → nuclease活性が考えられる

タンパク質の存在理由

1. 保護protect: DNA周囲について切断等を防ぐ
2. 酵素: nuclease - Super coil and relaxec circular DNA

1. untwisting topoisomerase: super coilをほどく。E. coliのW-protein (= DNA binding protein)
2. twisting topoisomerase = gyrase: α – Nal A 48 gene, β – Cau 82 gene → twistを作る

³H(¹⁴C)thymidine → 加熱後急冷denature (H-bondを切る) → ショ糖密度勾配 → 遠心

1. 親DNA鎖がほぐれ、その後+鎖–鎖上で短DNAが共に5' → 3'方向に合成 (a: 可能, b: 不可能)
2. 短いDNA断片(岡崎断片Okazaki fragment or piece)が別な酵素により繋ぎ合わされていく
3. 新しいDNAはどちらも5' → 3'の方向に短い断片として合成され、他の酵素により結合される

ligase less mutant → 断片DNAのまま

74上にilr gene (A B C)確認: ここから遺伝子複製開始

PX-174-typed E.coli
部分的 double strand

single strand_______**RNA__RNA合成___DNA__Replication form
__________________ polymerase

BP*: (single strand) binding protein - 切断を防ぐためDNAの周囲にタンパク質が付着
RF-1: ポリペプチド終了因子

これが再び輪を作りsingle strandとなりまた複製をする → 環状1本鎖は回転する

複製 (replication)

DNA複製の場所 (sites for DNA replication)

30" labelで核中に全放射能が分布 → 合成されるものが膜についているとは限らない
condensed heterochromatinがあり、それまで膜で合成されていると思われていた部分はheterochromatinを合成しているときを観察したものと思われる
核膜付近でDNA合成がなされているというのは否定的

isolated nuclei(核膜の外側を除去)
1% Triton × 100, low Mg, conc., light salt (2 M NaCl), Dnase Iで処理 → 遠心 → 沈殿

internal fibrogranular network: acidic proteins + RNA + lipid + (DNA) ⇒ 核のnetworkが合成の場

gene ↔ 非遺伝子DNA

コット解析 (cot analysis)

Ex. 50%再会合する場合をCot1/2と表現 → 大なら反応が遅い
⇒ DNA濃度分析可 (現在使われていない)

細菌DNA複製 (replication of bacterial DNA)

各データ比較し複製開始点をpin pointで示す

バクテリオファージDNA複製

最少培地: 野生型がやっと生活できる必要最小限の養分を加えた培地
完全培地: 突然変異種でも生活できる様々な養分を十分に加えた培地

     Glu  →    Orn  →   Cit   →  Arg →
             ↑              ↑             ↑
        酵素I     酵素II     酵素III     酵素を介した生物体反応
     遺伝子I 遺伝子II 遺伝子III
I         –           +              +          酵素I遺伝子が突然変異
II        +           –              +          酵素II遺伝子が突然変異
III       +           +              –          酵素III遺伝子が突然変異

一処理で多数の個所が変異する確率は極めて小

バーミリオン: V遺伝子突然変異 →

酵素V作用せず色素形成がそこで停止 → 朱色眼

シンナバー: Cn遺伝子突然変異 →

酵素Cn作用せず色素形成がそこで停止 → 辰砂色眼

スカーレット: St遺伝子突然変異 →

酵素St作用せず色素の形成がそこで停止 → 緋色眼

^a: ここの酵素が作用しない異常個体は出ていない
^b: 酵素I
^c: 酵素II

人の物質代謝異常

その後 …

• mRNA (messenger- RNA, 伝達RNA): 一重鎖で分子量5-50万。DNA塩基配列を写し取りリボゾームへ運ぶ
• tRNA (transfer-RNA, 運搬RNA, アミノ酸転移RNA): 80個位のヌクレオチドからなりMW 2.4-2.6万。1本鎖が真中から折れ曲がり2重螺旋をなす。リボゾームにアンチコドンの塩基配列により特定のアミノ酸を運ぶ
• rRNA (ribosomal RNA, リボゾームRNA): タンパク質と結合しタンパク質合成の場であるリボゾーム構成。RNA全体の70-80%占める

  遺伝子検査: DNAよりコピー数多く高感度検出に利点

RNA生合成

Polynucleotide phosphorylase: n·ppB (5'側にppがついている) ⇔ nPi: Mg⁺⁺必要
生成物がRNase sensitive。3'-5' phosphodigester
RNA as primer: 結果的にRNA鎖延長を行う。しかし、RNaseは延長よりも逆行の方をよく行う

⇒ 3人ほとんど同時に発見
RNA polymerase = DNA dependent RNA polymerase
n·pppB ⇔ (pB)n + nPPi: Mg⁺⁺必要
DNA as template, no primer - complementary

RNA replicase: n·pppB ⇔ (pB)n + nPPi
RNA as template, viral RNA 5' → 3'

RNA virus (プラズモウイルス) → [酵素] → RNA viral RNA (active): 細胞に感染増殖

MS2(f2, R17)全構造: 1RNA, 3569残基
Code: degeneracy in single protein, coat protein = 50 codons, A protein = 61 codons
二次構造

leader-codon-tail-polyA

Cap構造: 5'末端にある。TailにpolyA存在 – eIF3でCap結合タンパク質がmRNA認識のために必要
m⁷G → mRNA·43S → mRNA·80S
※ ウイルスmRNAは真核生物と同一

安定化 mRNA (stable mRNA)

→ 2分 = 有核のものと無核のものができる → 両方とも発生進む ⇒ stable mRNAの存在

→ タンパク質合成は継続された → stable mRNA存在
cf. 赤血球核は早々に消失するが合成は連続的である ⇒ long-lived mRNA存在期間が特に長いため

8細胞期: 14C-leusine (タンパク質に入る)と3H-uridine (RNAに入る)を取りこませ追跡
遠心分離しcytoplasmを調べた

Polysome: mRNAの合成されている証拠
: free mRNA, protein partiles = 情報粒子informosomes
各々のRNAピークをとってショ糖遠心等を行うとタンパク質がとれる = mRNA-protein complex

mRNA–polysomeの関係

Animal cultured cells
OP culture: high temperature: labeled mRNA

Cf. mRNA labeled by actinomycin-D = 0.5 μg/ml – rRNAだけを阻害, 5-10 μg/ml – 全てのRNAを阻害
したがって、薄いact-Dで他のRNA合成を阻害して³H-labelを行えばmRNAだけをlabel可能

→ heatにおいて温度を平常にするとcontrolと同じ曲線となる
mRNAの周辺を様々なタンパク質が取り巻き、様々な要因となっている

conserved mRNAを確認 = 乾燥種子中にmRNAがあることの実証

ダイズを水につけ吸水させた後、ホモジェナイズして遠心後にS100を集めショ糖密度勾配にかえる

*: RNA-protein complexとして種子中に存在

RNA一次構造決定法

RNA → DNA: 逆転写酵素(DNA primary structureを決定しRNA primary structureを判断する)

1) 未標識RNAを使用する場合 (unlabelled)

RNase T₁ = -Gp∧, RNase A = -Pyp (-Up∧ or -Cp∧) (∧: cut)

2次元展開 y方向 = paper chromatography, x方向 = 電気泳動

Pnase: -pNpN'p∧N'' → pN∧pN'
nuclease SW: -ApB∧pC∧p - X∧pY∧pZ∧p
PNPaase

oligonucleotide (DP small)
Ex. RNase T1 … XpGp
XpYpGp → XpYpG → X + pY + pG
______PMase___PDase

2) Sanger method (1965)

アミノ酸 → (タンパク質合成) タンパク質 → (タンパク質分解) アミノ酸
Ex. 血清アルブミンの半減期は17-20日

DNA遺伝情報 → RNA(DNA依存) → タンパク質(逆はない)

オペロン (operon)

E. coli: ブドウ糖をアルコール発酵により分解し生成するATPを利用する
乳糖のみを含む倍地に入れると約14時間経ってから乳糖を利用できるようになる → 乳糖が与えられると乳糖を分解するラクターゼ(β-ガラクトシターゼ)が約14時間で合成され、この酵素により分解される
誘導酵素: この場合β-ガラクトシターゼ
誘導物質: 酵素合成を誘導する物質。この場合乳糖(類似物でもよい)
1) 既に酵素を合成する遺伝子が存在する
2) 誘導物質が存在する

E. coli: ブドウ糖とNH₃があればアミノ酸を合成するが、既にアミノ酸(トリプトファン等)を加えた倍地では合成を抑制してしまう ⇒ 既に最終産物があれば生成過程を抑制させる

オペロン =
構造遺伝子: 酵素合成を直接支配。数多くあり構造遺伝子群をとる
作動遺伝子(オペレーター): 構造遺伝子(群)の一端にあり構造遺伝子の活動を左右する
調節遺伝子: 遺伝情報の発現を調節する ⇒ 調節物質作る。DNAの別な場所にある

トリプレット説 triplet

仮説: タンパク質のアミノ酸配列が核酸の構造単位の配列により決まる

DNAの塩基配列とアミノ酸(aa)配列が対応すると仮定すると、塩基はAGCU(T)の4つからなるので
4¹ = 4: 1つの塩基がaaを決めた場合
4² = 16: 2つの塩基がaaを決めた場合 - aa数(20)より小さい
4³ = 64: 3つの塩基がaaを決めた場合 - 全aaを作るのに十分
3つの塩基配列が1つのアミノ酸を決定すると考えた
⇒ 重複型トリプレット説: 2個づつオーバーラップしながらアミノ酸を指定する暗号となっている
トリプレット triplet: 3個の塩基配列

ヌクレオシド2リン酸からリン酸を離してRNA合成酵素を発見し、それから単ポリマーの合成に成功

重複型は1塩基配列が決定されるとその前後のアミノ酸配列が制約を受けるため不自然

1. 遺伝暗号はトリプレットで非重複型
2. 64通りのトリプレットコードtriplet codeのうち20通りがセンスコードで残りはナンセンスコード
3. コードとコードの間に句読点はなくてもナンセンスコードがあるので正しいコードだけ読める

[実験] E. coliを使い無細胞タンパク質合成系作る。この合成系に擬似mRNAとしてポリウリジン(-U-U-U-U-…)を加えるとタンパク質合成のためにフェニルアラニンが選択的に取り込まれた
[結果] mRNA: …-U-U-U-U-… → ペプチド鎖: フェニルアラニン-フェニルアラニン-フェニルアラニン
[考察] ポリUがフェニルアラニンの暗号(トリプレットUUUがフェニルアラニン暗号となることは後に実験証明)

Mammal, sea urchin, Drosophila: 5 μm
Yeast: 20-26 μm
Higher plants: 5-30 μm, 60-70 × 10⁶

[実験] 混合ポリヌクレオチド(混合ポリマー)によるアミノ酸コードの決定

    DNAにあたる    …TTCTTCTTCTTCTTC…
    mRNAにあたる   …AAGAAGAAGAAGAAG…
    [結果]
    合成ペプチド鎖 …LysLysLysLysLys…
                    …ArgArgArgArg…
                     …GluGluGluGluGlu…

[考察] 3つの塩基配列が1つのアミノ酸を指定する決定的な証拠となった
→ 2あるいは4塩基が暗号となっていれば暗号が何種類かになるので単独ポリペプチド鎖はできない
以後盛んに暗号解読がなされ1968年までにほとんど完成した

1番目  2番目                      3番目
(5'側)   U     C     A      G     (3'側)
  U       Phe Ser  Tyr    Cys    U
           Phe Ser  Tyr     Cys   C
           Leu Ser  Term  Term  A
           Leu Ser  Term  Trp    G
  C       Leu Pro  His    Arg    U
           Leu  Pro  His    Arg    C
           Leu  Pro Gln    Arg    A
           Leu  Pro Gln    Arg    G
  A       Ile   Thr  Asn    Ser    U
           Ile   Thr  Asn    Ser    C
           Ile   Thr  Lys    Arg     A
           Met Thr  Lys    Arg    G
  G      Val  Ala  Asp    Gly    U
           Val  Ala  Asp    Gly    C
           Val  Ala  Glu     Gly    A
           Val  Ala  Glu     Gly    G   
   Term = 終止コドン
   Met = 開始コドンにもなる

mRNA遺伝暗号 genetic code (コドンcodon)

3番目の塩基は変化しても同じアミノ酸を指定することが多い
Ex. Arg = 6コドン → 6重縮退

ホルミルメチオニンはタンパク質合成開始暗号で合成後ポリペプチド鎖から外れることがある

読むのはタンパク質であり、これを読む特定t-RNAがある訳ではない(virus → 停止暗号2つ続くとタンパク質合成停止)

開始機構 initiation

(分子サイズ、電気的特性等の問題多)
ribosome抽出: labeling済み確認 → ¹⁴N中で培養後ribosome抽出分離
→ 何型リボゾームが作られているか調べる ⇒ 70S ⇔ 30S + 50S

翻訳 translocation

[GTP数]
elongation: EFTu + EFTs = GTP1分子/ペプチド結合
translocation EFG: GTP1分子/ペプチド結合
extra GTP: mRNAのreleaseに1分子、その他?

原核生物(E. coli)タンパク質合成系

• IF1 (分子量 8119): 70Sの解離
• IF2 (90000): 70S上でGTPase。FMet-tRNA_Fの30Sへのbinding factor
• IF3 (20668): 天然mRNAのrecognition factor。30Sへの結合。多数の分子種。抗会合分子
• IF1 + IF3: 70S-AUG-FMet·tRNA_F complex生成

成長しつつあるポリペプチド鎖: 末端tRNAでタンパク質合成部位につないでいる。(1)成長しつつあるカルボキシル末端には常にtRNA分子がついている(N末端→P末端に合成)。この末端のtRNAがP部位またはA部位に結合することが、成長しつつあるポリペプチド鎖をリボゾーム上に保持する主な力となっている。

水素結合による特異的アミノアシルtRNAのn + t番目コドンの結合: この反応には成長因子TとGTPが必要。(2)ペプチド結合ができると成長しつつある鎖の結合場所はP部位からA部位に入る。(3)ペプチド結合の形成と同時ではないにしても、直後に自由になったtRNA分子はP部位から放り出される。

GTPのエネルギーを使っている


ペプチジルトランスフェラーゼ(PT)によるaa2とaa3間のペプチド結合の形成: この酵素は50Sサブユニットを構成するタンパク質の一つである。tRNAのP部位からの遊離


成長しつつあるポリペプチド鎖のついたt-RNAのA部位からP部位への転移: この反応には伸長因子GとGTPが必要。(4)新たに末端になったtRNAが次にA部位からP部位へ移動(転座tranlocation)。同時に小さい方のリボゾームサブユニットに結合しているmRNA鋳型は以前のn番目のコドンで占められていた場所にn + 1番目のコドンを持ってくるために移動する。
同時にmRNAが移動しn + 2番目のコドンがA部位にくる。(5)こうして空になったA部位はいつでも新しいAA~tRNAの特異性(次ぎに何が来るか)は、mRNA中のコドンとtRNAアンチコドン間の正しい塩基対で決められる。
完成したポリペプチド鎖は、普通最初のホルミルメチオニン部分を切り離し高次構造が作られタンパク質が完成する。

真核生物タンパク質合成系

• eIF1 (15K): 48S initiation complexの安定化
• eIF2 (122K): Ternary complex形成。40Sへmet-tRNAF結合
  α (32K): ±P (protein kinaseで) +Pで阻害
  β (35K): 因子全体の安定化?
  γ (55K)
• eIF3 (700K): Rabbitでは9 subunits
  (35K, 39, 43, 49, 69, 110, 130, etc.): 40S-eIF3, 4C complex形成。リボゾーム選択。MRNA認識と43 initiation complexへの結合?
• eIF4A (50K): 43S initiation complexへのmRNA結合
• eIF4B (80K): Cap-cap結合タンパク質の認識
• eIF4C (19K): 40S complex形成。48S initiation complexの安定化
• eIF4D (17K): 80S initiation complex?
• eIF4E (24K): Cap結合タンパク質。43S initiation complexへmRNA結合
• eIF5 (125K): 48S-60S joinase、AUG認識
• eIF6 (23-25.5K): 40S + 60S dissociation
• Co-eIF2A, B, C (20K, 450K, 200K): eIF2の補助

↓ eIF2 + GTP + Met-tRNA_|^Met
[Met-tRNA_|^Met&mdidot;eIF2·GTP]
↓ 40S小亜粒子
[40S· Met-tRNA_|^Met·eIF2·GTP]
↓ mRNA
↓ 60S大亜粒子
↓ eIF4A, eIF4B, eIF4C, eIF4D, eIF5
[80·Met-tRNA_|^Met·mRNA]

アンチセンスRNA

Ex. イネ: 米粒中に含まれるアレルギー原因タンパク質の生成を抑制

遺伝子発現過程 process of gene epression

1. 遺伝子の再編成
2. 転写
3. RNA合成
4. 翻訳
5. タンパク質の修正

古典遺伝学 classic genetics

なぜこの酵素がダメになったのかをbiochmical assay用い調べる = その酵素の発現機構調べる

改変遺伝学 reversed genetics

I. I. シグナル認識物質の同定 identification of signal DNA sequence

II. 細胞の種類

███ wild type, ░░░ mutant

III. 受精卵 fertilized egg

取りこまれた遺伝子は発生段階を経て脱落してしまうか、また取り残されている場合、どの細胞でどれ位の量が発現されているかを調べる → test of regulated expression → identification of signal DNA sequences

Findings of the component responsible for the regulated function

= gene rescue
遺伝子が付加的に入り込んで来たとき、その生物体にどのような変化が見られるか

ゲノム編集

TALE-Nuclease

CRISPR-Cas9

specific gene amplification in oocyte → DNA-RNA hybridization

1. これだけcopy数が多いと生化学的手法で遺伝子をisolationできる (Birnstiel et al. 1969, Gall 1969)
   100% genome DNA + 100% rDNA = 50% purification
2. 細胞分化cell differentiationの一端を伺い知るものとなる
   細胞が分化するということは、ある遺伝子を予め増やす機構のお膳立てができる
   type cell: 70-75% = rRNA (18S + 28S), 15-20% = tRNA, 5% = mRNAs, hnRNA, snRNA, ssRNA
   tRNAを100% pure努力行ってきたがrRNAに比べ極めて困難 ↔ rRNAを100% pureにするのは容易

   tRNAは数10種類のものがあり、1種についての遺伝子サイズが小さすぎる

(Suzuki & Brown 1972)

Isolation of sil fibroin mRNA

4つのピーク: 理論的にはIVのピークが消えたグラフとなる
→ pure mRNAが得られたと考えて良い(純度90%)
→ 単離して調べる

XG: Gly3番目ヌクレオチド = UG > AG > CG、CYG
___ Ala3番目ヌクレオチド = CUG > CAG > CCG
⇒ 遺伝暗号の比率がわかる

Detection of fibroin genes

____2 cells period________4 cells period
__中期_______終期
体細胞運命 chromosome

体細胞染色体は成長段階で不必要な部分が切り捨てられる
体細胞染色体(genomeの20%捨てる)と生殖細胞染色体(遺伝子)を比較
Hypridizationによる比較の問題点 → 全細胞で同じ結果を得る
1つのnucleotideが変化したらどうなる Ex. 機能消失 → 種分化へ応用

(Suzuki & Ohsima 1977, Ohsima & Suzuki 1977)

Isolation and characterization of fibroin gene

General ~ × 10^-6 = 3 pg (ex. mouse)

→ cloning ⇒ 転写開始末端必要 = より長い遺伝子鎖gene chain欲しい
⇒ 7/10000の頻度でfibroin geneがとれる
転写開始部のある長いgeneをとる

遺伝子構造解析 (structural analysis of the genes)

21 bpのところにmutation[normal = G, β⁺ = A]
始めの転写速度が遅い β⁺ matureなmRNAにsplicingできない

ex. 1______int. 1_____ex. 2
▓▓▓▓▓▓▓░░░░░░░▓▓▓▓
__________┃_┃___┃┗━━━━━┓
__________┃_┃____C*CCT*T*A*G*
__________┃_┗━━━━┓
___________C*TAT*T*GG* - normal
___________C*TAT*T*A*G* - β⁺

Intron 5'末端や3'末端の遺伝子が異種でも混在conserveされる。GがAに換わるとintron 3' siteとの類似性高くなる。本来intron 3' siteはexon 1の3'末端を見分ければよいが誤って21 bp付近を認識する可能性高

Transcription initiation
SI mapping method: initiation pointを決定する方法

実際の転写開始の信号 (Ex. AGT) = promoter

Hybrids arrest Ex. 数の少ないmRNAのクローン

抗体でpolysomeを落としmRNAをとる。しかし、この時期のmRNAも同時に取れるがそのままcopy DNAを作らせる → 調べるとintronのないものもある (ex. histone H₁, H₂A, H₂B, H₃,H₄などには無い)

生体外翻訳系利用 (use of in vitro transcription system)

Unique geneでなく、この3つを単位にNTS (non-transcribed spacer)となり転写されない。r-RNA large unitになる25-28Sの方はintronがあるがsmall unit r-RNAの方にはない。Drosophila melanogasterでは2500, 1200のcoding region間に50% 500, 1000, 5000のintron、15% 3000, 4000のintron、35%の非イントロンがある 反復配列repeated sequence: 長さ不均一 → NTS長変化

___AとBは同じ
比べるもの同士を1本の試験管に入れると +514: A >> B (dominance assay or competition assay)
重要なものが不足する。Wild typeのAがその重要なものを強引に取ってしまう
-238____-116____-73_____-53___-29_________+6
---|▓▓▓▓▓|------------|▓▓▓▓▓▓|-------|TATA__|▓▓|▓----------------
___↑_______________↑_____________↘ promoter
___↑_______ここが存在するとpromoter activityが一段と強くなる
ここが存在するとpromoterの活性がさらに一段と強くなる

= enhancer-like element ⇒ enhancer element (DNA) → SV40, plyoma etc.に似た性質がある

    P.S.G. cell    Fibroin gene   Sericin gene
    後部絹糸腺         +++              –
    中部絹糸腺          –              +++

Ad geneはHela extractで良く発現 ↔ PSGではそれ程でもない
B regionの働きはHela extract中で見られるがPSGで見られない

        Hela                PSG
        Ad   Fib  Globin    Ad   Fib  Globin
        ▅▅▅▅                ▂▂▂▂
             ▅▅▅▅                ▅▅▅▅
                  ▅▅▅▅                ▁▁▁▁

hnRNA → (processing) mRNA = 初期転写産物 primary transcripts

一般的特性

リプレッサー repressor: DNAのプロモーター近傍に位置しオペレーターに結合し遺伝子発言を抑えるるタンパク質性転写調節因子
⇔ アクティベーター activator: リプレッサーと逆の役割

1) Exon-intron junction: IntronのGT-AG mule

        Exon  Intron	       Exon
          →→→  ↔↔↔↔↔↔↔↔↔↔↔  ←←←
        A … CAT  GTAAG … AG  G …
        B … AAT  GTAAG … AG  G …
        C … GAG  GTAAT … AG  G …

Intronの最初はGTで最後がAGになるもの多 Ex.chicken avalbumen gene, rabitt α globulin gene, mouse b globulin geneは全てこれに従う

2) Pormoter

de in vitro: analysis of product
in vitro: 1979 Roeder BがKB cells, 1980 ManleyがHela cells
in vivo: Birknstiel Xenopus eggから抽出された酵素

Conalbumin … TATA … → … TAGA … 機能するが効率落ちる

Rabbit β-globlin gene: -40から-100 ⇒ TATA boxより優先される決定因子

Modulator

-184 ~ -524: E-region, +1: efficient-beginning position
E-regionが消失し、その後+1の位置に変化が見られる → E-regionはmodulatorではないか

Enhancer (Activator)

1. short base sequence
2. cis配位
3. 逆になろうと構わない = 方向性は無関係
4. 隣接している必要はない
5. 活性部位の下流でもよい
6. 活性部位にあるものは何でも良い (T-antiqueの必要はない)
7. SV40をpolyomaに交換可能
repeated sequence consensus = 15 base

Termination signal

______R U₅____________U₃ R___3 (3 primer), 5 (5 primer)
V-RNA ●------------------------------●
_____________↓ reverse transcriptase
_______L-LTR_________________R-LTR
__░░░░████████===========████████░░░░░░░░░
_________________U₃RU₅_________________U₃RU₅(polyA)
_____________________この時点ではdouble strand
_________↓ incubation to host
___ → mRNA or rRNA

Transcription of 5S DNA: ~20000 copies/genome
5S RNAはsplicingされるprecursorないので一次転写産物はすぐ実用できる

"in vitro genetics" proposed by Brown
= reversed genetics (sensu lato) by Weissmann

これを用いて発現機構を調べる
                           +           120 bp    前からcut        transcription
------------------------▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆-------------------- (+++)
------------------------▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆-------------------- (+++)
------------------------▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆-------------------- (+++)
----------------------------▆▆▆▆▆▆▆▆-------------------- (+++)
--------------------------------▆▆▆▆▆▆-------------------- (+++)    +51までcut
------------------------------------▆▆▆▆-------------------- (-)
----------------------------------------▆▆-------------------- (-)

次に3’側からcut (Bugenhagen, Sakonju & Brown 1982)
━━━━▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆━━━━━━━ +++
━━━━▆▆▆▆▆━━━━━━━━━━ - (+90までcut)

+51から+90の間に何らかの転写開始要因がある: 遺伝子制御 = control region ≈ promoter
Control regionに:

1. 何らかのtranscription factor (purified 5S gene specific factor)が結合する
2. 5S factor/5S RNA complex (7S particle)
3. Auto-regulation system: 5S factorの量でRNA生産量は決定される

======================
____↓ DMS
====================== CH₃
5S factor bindig
______________+40____+50____+60____+70____+80____+90
non-coding strand ··············································GG···········GGATGGG···
coding strand____----------------------------------CC--------CCTACCCG---
_____________________↓ 5S RNA______________________+91
_______________----------------------------------GG--------GGATGGG----
Gを阻害(= methylation)

-------████------- + nuclear extract (5S factor + histones)
______↓ complex
transcriptionally inactive

left____GGTCTAGTGG
right___GGGTTCAATCC
_______= consensus sequence
TGGCNNAGTGG__GGTTCGANNCC: Nには任意の塩基が入る

tRNA^Lys, histon, polymerase III → chromatin reconstruction
nucleosome – 8量体ヒストンは中心でのみtranscriptionされる

受精卵細胞質 - 雌性配偶子由来 → 遺伝形質は常に雌親と同

☛ ミトコンドリア

ミトコンドリア遺伝子 (mitochondrial gene, mt gene)

mtが有するDNA情報量 < 核DNAの1/10

I(40000) II(22500) III(15000) IV(11200) V(9800) VI(7300) VII(?)

II = mtDNAから
V = 核DNAから → 前駆体ポリペプチドは親水性で細胞質で合成

N末端には疎水性(脂溶性)アミノ酸が多い
cytochrome oxidase subunitは膜中に埋め込まれていると考えられる
Diazobenzen sulfonate試薬(非特異的結合)による検出。膜両面から試薬を与え反応度合いを調べる。M-sideではIIIが、C-sideではII, V, VIが強く反応するが、I, IVはいずれでも反応しづらいことから予測された

L8S8 × 16サブユニット → L8 = mt DNA, S8 = 核DNA

葉緑体遺伝子 (chl gene, chloroplast gene)

プラスミド (plasmid)

染色体DNAから独立し複製 (染色体と同調し複製)

細菌生存に関係なくある程度の数だけ増殖 → 協調関係

Ex. sex factors, colicin, λ-phage (≠ ミトコンドリアDNA、プラスチドDNA)

人為的例: acridin (Hirota 1960), SDS (Tomoeda 1968), Ni, etc.

= 閉じたループ closed loop

Ex. 一ヶ所切断すると、プラスミドがocDNA (open circular DNA)となるためcccDNA (covalently closed circular DNA)であることが解析できる

______DNase
CccDNA ⇄⇄⇄& ocDNA
_____DNA ligase

1.2-1.5 MDt (106 dt)が最初のプラスミド。例外的にpBR345 (0.7 MDt)という極小プラスミドが知られるが、これはdimerをなし結果的には1.4 MDtである。最小プラスミドは1.2-1.5 MDt位といえる

F⁺ strain: 独立した形で保有しているもの
Hfr strain: 主染色体に入り込むタイプ
F' strain: プラスミド中の遺伝子を主染色体と一部すりかえるか、残していくか、または取り去っていくもの
F' lack × F⁺ → F⁺, F' lack → やはり2タイプの株が形成される

主染色体の耐性能力としてはリボゾームタンパク質構造の変形による程度の能力しか有していない。ところが、R因子は抗生物質に変化を起こさせる(Ex. アセチル化による抗生物質不活性化)ことで耐性獲得。しかもR因子のR⁺からR^-への伝播は早い
F factorとR factorは、結構阻害等の干渉はあるが共存できる – F pili

このプラスミドは他細胞上に伝播可能なものと不可能なものがある
伝播は他プラスミドに乗り他細胞へ移動 (一般にF factor利用)

伝播可能      Col B, Col E                F pili形成に関与
                     Col I                            I-like pili形成に関与
伝播不可能   Col E, Col E2, Col K

分解プラスミド degradation plasmids

naphthalene – NAH plasmids, salicylate – SAL plasmids, Camphor – CAM plasmids, n-octane – OCT plasmids, toluene, xylene – TOL plasmids のように資源化能を有するプラスミド

Fertilized egg利用assay system

Mouse PMK  +K enzyme        + K mRNA (■: 発現した)
                     Liver  Kidney  Brain  Liver  Kidney  Brain
  19-2     +     1.37   1.44       ND     2.5      3.4       ND
  21-1     –
  21-2     –     1.89   2.26       ND
  21-3     –
  23-3     +     1        2.05       1.5
  23-2     +    66.8    4.44       1.23    28 <    22 <      2

(Wanger et al. 1981, Constantini & Cacy 1981,
Gordon & Ruddle 1981, Brinster et al. 1981)

human growth hormone本体部分detect → mouse

#pMGH/ mRNA/  Growth    Growth
    cell        cell     hormone  ratio 
                            (μg/ml)                
    20         800          57         1.87 ×
      1        < 50            0.87    1.02
      8              1.32
      2
      2
    10       1500          32          1.69
    35       3000        112          1.78
      0             0            0.16
      0             0                                 

Copyする数多いほど発現量多 - Growth hormoneは一般に脳で合成される。しかし、実験では働くpMTのpromoter + 上流部を持っているから生成されるに他ならない

ショウジョウバエ卵にgene注入
hybrid dysgenosis: P. strain ♂, M strain ♀
P element存在(トランスポゾン) ~3 kbp
P elementが入ると、このmutantが異常をきたす
Ex. wild typeに戻る、extreme sn等
→ P elementの中間部分をとりryt geneを入れ込んだ

DNAマーカー DNA marker

+ 対象分離集団選択や遺伝実験系統の活用がマッピングの効率化の鍵

実験手法に基づく分類

1. サザンハイブリダイゼーション

制限酵素で切断されたDNA 断片長が種内個体間で異なる(= 多型)こと

Ex. 犯罪捜査で個人特定。遺伝病診断
Ex. ACGCT切断制限酵素
多系解析 → 元DNA同一なら断片長分布は同じ(= 同一個体DNAと推定)

1. DNA抽出(1滴の血痕、毛髪1本で十分) → PCR
2. 制限酵素 restriction enzyme によりDNA切断
3. DNA断片をアガロースゲル電気泳動
4. 特殊ナイロンシート等をゲルに押し当ててゲルに含まれるDNA断片をシートに移し取る
5. DNA検出用放射性物質(プローブ)を作用させX線フィルムに感光させる = フィンガープリント

タンパク質特定部位切断制限酵素 - 断片はタンパク質毎に独特の特徴
⇒ タンパク質全配列分析せず、タンパク質の異同を判定する簡便法開発

2. PCR (polymerase chain reaction, PCR)

• マーカー (原理) 検出変異(ゲノム中量 多系度 1回調査可能遺伝子座数) 必要DNA量, 塩基配列情報
• RFLP 遺伝子置換, 欠失/挿入(多中少) μg, 不要
• Minisatellite (ゲノムDNA制限酵素反応) 反復数変化(中高中) μg, 不要
• Microsattelite (SSR挟むprimer PCR) 反復数変化(中高少) ng, 要
• RAPD (random primer PCR) 遺伝子置換, 欠失/挿入(多中中) ng, 不要
• RAMP (anchor primer/random primer PCR, 制限酵素反応) 反復数変化(多高多) ng, 不要
• SSCP (PCR, 制限酵素反応/DNA変性) 遺伝子置換, 欠失/挿入(多高中) ng, 要
• CAPS (PCR, 制限酵素反応) 遺伝子置換, 欠失/挿入(多中少) ng, 不要/要
• AFLP (ゲノムDNAの制限酵素反応, アダプターのライゲーション 選択的primer PCR) 遺伝子置換, 欠失/挿入(多中多) ng, 不要

微量遺伝子をin vitroで純粋に十分量まで増やす → 様々な解析

+ dATP, dCTP, dGTP, dTTP + primer + DNA polymerase
⇅ [反復]

DNAを数時間で100万倍に増幅
PCR: 熱変性により1本鎖になったDNAにプライマーを結合させる反応

アンプリコン(増幅産物) amplicon: PCRで増幅されたDNAのこと

温泉中の高温耐性菌 → 耐熱性DNAポリメラーゼ(Taq DNA polymerase) = 94°Cでも失活しない
何度サイクルを繰り返しても減らない

3段階温度変化を周期的に行う(サーマルサイクラーで完全自動化)だけ
Ex. ピコグラムDNA (pg) → 30回増幅 → μg (数時間弱で10億倍)
熱変性: (鋳型)2本鎖DNAに熱をかけ1本鎖DNAに解離させること

プライマー: 鋳型DNAに相補的な塩基配列を持つ合成オリゴヌクレオチド(短い1本鎖DNA, 10個程度)。増幅領域挟むよう2か所設計 = ペアをforward/reverseまたはsense/antisenseと呼ぶ

ゲノムDNA塩基配列上に個体間差存在 → 増幅DNA断片の種類・大きさに違い(= RAPD)

プライマーダイマー: プライマーを鋳型とし合成される目的外の増幅産物。プライマー同士で相補配列存在 → その部分がアニーリングし通常のPCRと同様に指数関数的に増幅 → 増幅サイズ短いため目的増幅産物よりも増幅効率高いことがある → 検出感度低下

試薬にIC添加された系: IC増幅 = PCR阻害はないと判断 ⇔ ターゲット、ICともに増幅認められない = 偽陰性の疑い

鋳型(テンプレート) template

RNAはDNA polymeraseの鋳型とはならない → RNAをDNAに変換

転写: DNA → RNA ⇔ 逆転写: RNA → DNA

cDNA (complementary): 逆転写でRNAから変換されたDNA

= PCRの鋳型 ⇒ RT-PCR: RNAをPCRで増幅する手法

反応液調製時に、1反応分ずつ混合するのは操作性が悪く、正確性にも欠ける ↔ 鋳型以外の反応液(マスターミックス)をまとめて調製

リアルタイムPCR (real time PCR, quantitative PCR, qPCR)

利点: 電気泳動不要 = 迅速・簡便・定量的解析可能

サイクル数(X軸)-蛍光強度(Y軸)関係をみる曲線

= PCR増幅産物がある一定量(閾値 threshold)に達した時のサイクル数
初期鋳型量多いとCt値小、少ないと大 → Ct値-初期鋳型量に相関関係
⇒ 検量線作成 - 未知サンプルの定量可能

クエンチャー(消光物質): 蛍光物質の蛍光を抑制する物質

サイクリングプローブ (qPCR蛍光検出法)

一末端が蛍光物質で、他末端がクエンチャー物質で修飾

サイクリングプローブのRNA付近にミスマッチ存在 → RNase Hによる切断なし → 配列特異性高い検出が可能 - SNPsタイピング等に最適

インターカレーター法 (qPCR蛍光検出法)

プライマーのTm値はPCRのアニーリング温度を決定する参考

PCR反応後、反応液温度を60°Cから95°Cまで徐々に上昇させ蛍光値をモニタリング → PCR産物が2本鎖を形成した状態では強い蛍光を検出 → ある一定温度(Tm値)に達すると1本鎖に解離し蛍光値が急激に低下 → Tm値はPCR産物の長さやGC含量により異なるので、目的増幅産物とプライマーダイマー等の増幅産物を区別できる

→ 可視光照射によりDNAに共有結合
細菌にEMA処理 → 生菌: 細胞膜に阻まれEMAは菌内部に浸透しない ↔ 細胞膜損傷した死菌: EMAが菌内部に浸透 ⇒ 細菌内に浸透したEMAはDNAに結合し光照射を行うとEMAがDNAに共有結合

電気泳動でDNA検出時に使用。発癌性(取扱注意)

dTTPの代わりにdUTPを含む基質を用いPCRを行い、増幅産物にU塩基を取り込ませる。このPCR産物に対しUNG処理を行うと、U塩基の部分で加水分解され、キャリーオーバーを防止

マルチプレックスPCR

増幅産物の電気泳動: 各ターゲットを増幅サイズにより区別し検出
qPCR: ターゲット毎にプローブの蛍光標識物質を変え区別し検出

コンタミネーション contamination

高感度検出法 → 微量DNA混入 → 増幅され判定結果に大きな影響

高濃度DNA溶液の取扱には注意

遺伝子検査

MIG-seq法

ISSR = inter-simple sequence repeat

1. Schmidt, Thannhauser, Schneider法による核酸抽出

0.5-5 g(w/w)のsampleを冷えた乳鉢mortar中でpestle乳棒を用いて、すり潰しながら10-20 mlの冷やした5% PCAを加え良くかき混ぜる
a) 10000 rpm for 5 min
b) pptを10-20 mlのcool PCAに懸濁

a-b → 3回繰り返す

c) pptを得る
良く冷やし手早く行う(暖まると酵素の影響や特にプリン塩基がはずれStep 3で分解されやすい)

a) Step 1のpptに95% Et-OHを10-20 ml加えて良く混ぜる
b) 5000 rpm for 10 min
c) pptに95% Et-OHを10-20 ml加えてよく混ぜる
d) 5000 rpm for 10 min
e) pptにEt-OH-Ether (3:1)を10-20 ml加えしばらくかき混ぜる

→ d-e: 3回繰り返す

f) (真空ポンプかドライヤーで) pptの溶媒をとばしsampleを乾燥させる

(ドライヤーではsampleが吹き飛ばないよう注意)

a) Step 2の乾燥pptを0.5 N KOH 37°C, 16-20 hrで処理

(加えるアルカリ量はfresh sampleあたり10 ml程度)

b) 冷やしながら6 N HClで中和(濃PCAによる中和も可能)

DNA proteinが肉眼で見える

c) 10000 rpm for 5 min
d) pptを5 mlの5% PCAでよく洗う → 2回繰り返す
e) 上清中にRNAがモノヌクレオチドとして存在する

Step 3のpptを5 mlの5% PCAに懸濁させ90°C 15 min放置(塩基遊離)
→ 冷やした後2500 rpm for 5 min
→ pptを5 mlのPCAに懸濁 → 2500 rpm for 5 min → 洗液・抽出液(上清中)にDNAが存在

2. Ceriottiの方法によるDNA定量

DNA、0.04%インドール酢酸(難溶時は温水使用、冷所保存)、濃塩酸(SG 1.19)、クロロフォルム(高純度)

1. 2.5-15 μgDNAを含む試料2 ml
2. インドール試薬1 ml、濃塩酸1 mlを加え良く振る
3. 沸騰水浴中で10 min加熱
4. 冷却後4 mlのクロロフォルムを加えて良く振る
5. 遠心し夾雑物による呈色物抽出する(水槽透明になるまで大凡3回位)
6. 水槽の黄色呈色を490 nmで測定

抽出DNA sampleは2-3種類の濃度について同様の操作を行い定量。この方法では3.3%以下のPCA混入は影響が無い。又DNA濃度が低くPCA混入が大きくなる場合には濃縮する

3. DNA塩基組成分析

1. PCAによる分解: 共栓試験管に60% PCAをDNAが6-8%になるよう加え栓をし100C, 1 hr加熱。冷却後、等量の水で薄め炭水化物を軽く遠心し除く
2. PC: 核酸として200-500 μg (vol. 10-20 μl)をspot (Toyo 51A filter paper)し展開し乾燥させる
3. 検出: 260 nm光に乾いたpaperをかざし黒いspotとして検出される塩基化合物部分をマーク。マーク部分を切り取り共栓試験管に入れ0.1-1 NのHClを加える(抽出37°C 1 day、室温の場合は数日放置)。濾紙片が入らぬように上清をとり吸光度A₂₆₀を調べる

補:   1. 6 mg/0.1 ml   2. spotは正確に置き、乾燥後、展開を15-20 cmまで行う   3. 250-260 nmの単一波長が良い。今回NISO₄·7H₂O 3.5 g, CoSO₄·7H₂O 10 mlにしたものがca 260 mnを選択的に通したためそれを利用した

_____________________________________A____G____C____T
methanol:concentrated HCl:water = 7:2:1__0.31__0.18__0.70__0.42
n-buthanol:0.6 N ammonia = 6:1_________0.64__0.23__0.89__0.42

検出には少なくともRf値が0.1以上の離れた展開液を用いる必要がある
検量線作成のための既知DNAの定量: 2回測定しその平均で作成

→ 7.5 (μg/ml), 15, 21, 24, 27 → 吸光度 = 0.088, 0.167, 0.213, 0.247, 0.250
抽出DNA定量: × 100は高濃度のため検量曲線上に乗らない - 除外

稀釈倍率___1st___2nd____Av___μg/2 ml sample
× 100____0.228__0.306__0.267__2540
× 200____0.157__0.161__0.159__3020
× 300____0.099__0.100__0.100__2925

得たDATAから2972.5 μg/2 ml sampleが得られる

4. イオン交換カラムクロマトグラフィーによるDNA塩基解析