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(2020年3月3日更新) [ 日本語 | English ]

遺伝子 (gene)






有珠山 / サロベツ泥炭採掘跡
1986年, 2006年の有珠山火口原. ワタスゲ・エゾカンゾウ

遺伝子 gene

初期: ゲノムもしくは染色体の特定位置に占める遺伝単位 (≈ 遺伝子座)
現在 (s.l.) 塩基配列にコードされた遺伝情報

(s.s.) タンパク質一次構造に対応する転写産物(mRNA)情報もつ核酸分子上特定領域(= 構造遺伝子, シストロン)

シーケンス解析: 塩基配列を解析すること

塩基配列(DNA配列): DNAを構成する塩基(AGCT)の並び方

核酸 (nucleic acids)


核酸研究 studies on nucleic acids

1869 ミーシェル: 膿(白血球死骸)から核細胞分離(命名ヌクレイン nuclein)

高P(リン)含有 = 強酸性で高粘性

1871 ホッペザイラー & ミーシェル

red blood cell, yeast, yolk等から同物質取出す(他研究者達追試)
サケ白子(精子)からもnuclein発見

1872 ミーシェル

白子(精子)が含む塩基性タンパク質(プロタミン)がnucleinと結合していることを発見

1883 コッセル: 白血球からプロタミンと異なるヒストンを取り出す
1889 アルトマン: ヌクレイン(核物質)を核酸(nucleic acid)と呼ぶ → 普及
1901 コッセル: G, C, T, A, Uを核酸から分離し化学構造決定

→ 核酸は2種類ある

1902 レベン: 酵母菌の核酸に含まれる5炭糖 = デオキシリボース
1937, 38: フォイルゲン & カスペールソン

DNAは核内のみに存在 (→ 否定)

1940's → RNAは植物細胞質・核内だけでなく、動物細胞細胞質も含む

RNAがタンパク質合成に関与していることが強調される

1960年代(50年後半): 14C操作容易になる

→ 研究盛ん: 14CO2, 14C-amino acids中から得られた
後に32Pに移る

PCG, ion-EC centrifuger開発、分子篩、UV測定装置開発(光電池・回析格子)等の組合せで測定
Table. 種々細胞RNA, DNA, protein含量(RNA, DNA, protein含量合計を100%とした)
                                 RNA   DNA   Protein RNA/
                                 (%)   (%)    (%)    DNA
  細胞
    ハツカネズミ肝臓             4.8   1.3    93.9   3.7
    ハツカネズミ肝癌細胞         6.2   2.0    91.8   3.1
    タイコクネズミ肝臓           5.7   1.3    93.0   4.4
    ダイコクネズミ脾臓           5.2   5.2    89.6   1.0
    ニワトリ胚心臓               4.4   2.2    93.4   2.0
    モルモット脳                 2.8   1.2    96.0   2.3
    子ウシ胸腺                   -     -       -     0.4
    ヒト腎臓                     4.0   3.0    93.0   1.3
  核
    子ウシ胸腺                   1.7   26.5   71.8  0.06
    子ウシ肝臓                   1.5   15.6   82.9  0.10
    ニワトリ腎臓                 2.0   15.0   83.0  0.13
    ダイコクネズミ肝臓           4     17     79    0.24
    ダイコクネズミ腹水肝癌細胞   4.7   22.3   73.0  0.21
    モルモット肝臓               5     13     82    0.33
    エンドウ発芽幼胚             7     16     77    0.44

(核酸分析)

核酸構成成分と組成分析

= DNA + RNA
= 塩基(AGCT/AGCU) + 糖 + リン酸

核酸の化学修飾

base, nucleoside, nucleotide, RNA(アルカリに弱い) ⇔ DNA(酸に弱い)
ヌクレオシド nucleoside: N-glycoside bond

1) nucleic acid酸に弱い
2) dG: pH3で遊離, U: 1N HClでも安定

ヌクレオチド nucleotide

NMP: 比較的安定。NDP, NTP, cyclic NMP: 不安定, ATP ⇔ ADP + Pi

索引
実験系
pH 5.5-8.5, Temp. 0-37°C, time: 短いほど良い
Buffer: 制限多

Ex. アミンbufferはアルキル化に、カルボン酸・リン酸bufferはエステル化に使えない

試薬: 制限多 = 水に溶け分解されないもの
i) アルキル化 alkylation: アルキル基を転移する反応 → 核酸塩基の人為的化学修飾に使わる

メチルメタンスルフォン酸、エチルメタンスルフォン酸などがよく使われる
nucleic acid
(CH3)2SO_3'_______CH3I 7' 中性________(CH3)2SO 3'_CH2N2 3'
CH3______1_______アルカリ 1'

ii) ハロゲン化

U, C → [Br2] → 5-Br*
G, A → [Br2] → 8-Br

iii) シアノエチル化

CH2=CH-CN, pH 11.5 - all reaction, pH 8.8 - none
nucleic acid

iv) CNBr

nucleic acid

(Canellakis et al. 1959)

ヌクレオチドのde novo生合成

ピリミジン pyrimidineはプレハブ工法、プリンpurineの方は在来工法によって生合成される
プリンヌクレオチド purine nucleotides: PPiの存在 → 生合成系の阻害/生体に対しては有利な機構
nucleotide

G, Aのプリンがお互いを制御する
*: nucleoside diphosphate reductase
生体系中ではチミンは重要であるが、起源としてはウリジンがチミンに変わるのが一般的

1963 Hotta & Stern: Trillium erectum, meiosis

DNA
3H-TdR → 3H-TMP変換の様子__Thumidine keinaseに制御される

1964 Leong et al.

Rat liver, hepatectomy: 肝臓一部切除し再生regeneration過程観察
再生のためのDNA合成: dGTP/dCTP/dATPでは再生せずdTTP必要

1979 Hovemanna & Follmann

Vicia favaの発芽抑制機能 → 給水するとribonucleoside-S'-diphosphate reductaseを作る

デオキシリボ核酸, DNA (DNA)


1920' Levene: DNA塩基はC, T, A, Gである
1922 Griffith F: 肺炎双球菌で形質転換transformation発見

肺炎双球菌
DNA 有膜型(S型, smooth colony)

多糖類の膜(白血球から体を保護する)
病原性あり。感染すると発病する

無膜型 (R型, rough colony)

病原性なし。感染しても発病しない

ネズミに

R型注射 → 発病せず
S型注射 → 発病死亡
(R型 + すり潰したS型菌)注射 → 発病死亡

死亡したネズミの体内にはS型菌が存在 → 形質転換

1944 Avery OT, マクラウンド、マッカティー

R型菌をS型菌に変化させたのは、すり潰したS型菌の何が加えられた時かを調べる
→ S型菌DNAが加えられたときにR型菌は形質転換
核酸(DNA)は比較的単純低分子物質 → 発表直後遺伝形質を担う物質がDNAととは認められなかった

当時の認識

遺伝子: 安定物質で種によりほぼ一定。体細胞には生殖細胞の2倍量
DNA: 細胞内で種ごとにほぼ一定。体細胞には生殖細胞の約2倍
タンパク質: 遺伝子に相応しい存在の仕方ではない

1949 Chargaff E: A = T / G = C → A + G = T + C
1952 Hershey AD & Chase M: 放射線標識法によりDNAの働き解明

大腸に寄生するT2ファージ: CHON(SP) – タンパク質、CHONP – 核酸

  1. T2ファージを放射性32PO4, 35SO4を含む培地で培養: 32P → DNAに入る, 35S → タンパク質に入る
  2. 放射性元素を含まない培地で大腸菌に感染させる
  3. 大腸菌中に入って新しいT2ファージを作るのは32Pを含んだDNAか35Sを含んだタンパク質かを調べる

→ 大腸菌内に入りT2ファージを作るのに働いたのはDNA

Q. タンパク質が遺伝子、DNAが酵素の役割をしている生物での遺伝情報の伝達はどのようなものか(m-RNA相当物質は考えなくても良い)。この生物にはどのような不都合が起るか
Q. DNAの2重螺旋を形成しているAとT、GとCの水素結合による結合の状態を書け。この構造を考慮し、DNAの減色効果を説明せよ

DNAのつなぎかえ

1976 Tonegawa

________________つなぎかえ
マウス胎児 ──▓▓▓───────▓▓▓───── not function
↓ 発育________V____ ______C
成熟______────▓▓▓─▓▓▓───────── function
________________V____C
発育過程でDNAの繋ぎ替え(再配置)起こり細胞によりDNA配列異なる

高等生物遺伝子組換 (組替体 recombinant)
遺伝子: 交差 crossing over → 組み換え recombination
____________ mRNA → 逆転写酵素 → ━━━━━━━

→ アルカリによるRNAの分解 → ___________
→ 逆転写酵素またはDNAポリメラーゼ → ‹==========
→ SIヌクレアーゼ → =============
→ ターミナルトランスフェラーゼ → recombinant
→ DNAポリメラーゼ, DNAリガーゼ → recombinant
recombinant
→ これをホストのgenomeに乗せる: Interinjection →
recombinant

組込遺伝子は他植物の特異的タンパクを生産する遺伝子 → オパイン・オクトピンなどのタンパクを生産
マイクロインジェクション microinjection: 本来の意味ではin vivo(in plasma membrane or cell membrane)での転写システムとして開発された

細胞融合 (cell fusion)

1957 岡田善雄

エールリッヒ癌細胞にHVJウイルス(センダイウイルス)を働かせると細胞融合が起こる
現在ではポリエチレングリコールなどによっても異種細胞の融合ができることが知られ広く応用される

recombinant
図. 細胞融合過程

DNAの構造 (structure of DNA)


1953 Watson JD & Click HC (+ Wilkins M 1962 ノーベル賞)

二重螺旋モデル
→ Franklin RがX線解析データを提供

DNA二重螺旋モデル double helix model

DNAの遺伝子としての性質は良く当てはまり複製の仕組み、遺伝情報の解明等、分子遺伝学発展に貢献
塩基対の配列順序: 規則性はない(まったく自由)。この中に遺伝子が存在(3個の塩基配列 → 1アミノ酸)
螺旋(右巻き) 34Åで10個の塩基対が存在。直径20Å

Cf. chloroplast DNA (organellaは寄生したprokaryote) → circle

extrachromosomal element: 核様体でない物質 cytoplasmic element: 核様体以外の部分にある物質

Viruent virus
viruentviruentviruent
replicationがbacteriaとvirusで別_________別なbacteriaへ
Lysogenic virus
viruent ↗ Virulent
viruent
_____________溶原化 integrate ∴ coordinateで増える
__________________= one replicon ex. λ, φ
プラスミド plasmid: virusと異なりバクテリア生存に関係なくある程度の数しか増えない → 協調関係

F-factor = バクテリア性決定 extra-chromosomal elements

コリシンファクター colicin factor: 性染色体外遺伝子

分子形態

1) 一本鎖DNA (single strand DNA)
φX174 → circular, single strand

(MW 1 × 106 dalton, 5375 bases, 9 genes判明)

φX174はdouble strandのものもある(= RF-DNA)

- replicationの際形成
M13, G4 phageはsingle strand

2) 二本鎖 double strand DNA (上記以外全て)
Watson & Click model – 右巻き, Rich – 左巻きも存在
a) circular double strand DNA

mitochondoria DNA, chloroplast DNA SV-40 DNA – virus DNAでありながらproteinと結合(nucleosome-like strand)

1975 Helinski et al.

DNA → ligase (by リゾチーム)

Plasmid (E. coli)

DNA → 界面活性剤 → 遠心
→ DNAおよび3種のproteinと結合

環状DNA (circle DNA)
b) linear DNA

DNA
______________________糊代部分
DNA

相補的に”糊代”的働きをする = 粘着性末端cohesive end

template phage, λ phase → 感染するとcircleになる
粘性が下がるにつれてcircle DNAが増す(Φ80, Φ82, Φ21によって調べられる)

Vivulent phage T2, T3, T4 – 複製時にcircle

Ex. T4
DNADNA

_________________切れて結びつく – 組換え重複する
_________________exonuclease III – 末端重複 terminal redundancy

DNA一次構造決定法 (DNA primary structure - sequencing)

1) Sanger method (Sanger-Lovlson)
5', 3' sites付近の解析
labeling

5' site: polynucleotidekinase [γ32P]ATP
3' site: 末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼ [α32P]dNTP
DNA

2) DNA polymerase利用
= classical

DNA
known______________unknown
▓▓▓▓▓▓ ---------------------------→
primer
dNTPの組成を変え転写状態を比較。NをG only, G + Tなどに変える

3) RNAに転写

───┬┬┬┬┬─────────── DNA
───┴┴┴┴┴─────────── RNA
_____primer_____後の手順は(1)と同様

4) Sanger-Loulson method (Sanger +,- method)

3' ───┬┬┬┬┬──────────────── 5'
5' ───┴┴┴┴┴───────────▶
dATP, dGTP, dCTP, [α-32P]dTTP等のように1つをlabelingする
転写を様々なパターンで途中で止める
それを4種のdNAPのうち1つが欠けた系で複製させると様々なパターンの中からその反応を止めた長さの所の塩基がわかる。 Ex. -A系、+A系等で、同様に残り3種も行う。これら8種の系を電気泳動にかける

______-C__-T__-A_ -G_ +C_ +T_+A_ +G
     ┣━┫  ┣━┫  ┣━┫  ┣━┫  ┃
     ┣━┫  ┃  ┣━╋━┫  ┃  ┣━┫
     ┃  ┃  ┣━┫  ┃  ┃  ┣━┫  ┃
     ┃  ┣━┫  ┃  ┃  ┣━┫  ┃  ┃
     ┃  ┃  ┃  ┃  ┃  ┃  ┃  ┃  ┃

1回に100-150 bases決定可能

5) Maxam-Gilbert method
プリン → A N-3, G N-2 (メチル化)
ジメチル硫酸 - 短時間処理により平均1本鎖に1箇所程度のメチル化が起るようにする
→ 加熱 = Gが脱メチル化 / 希酸 = Aが脱メチル化 → メチル化した部分が切れる (G > A, A > G)

アルカリ処理________ ______ ______
DNA

ピリミジン

→ 塩基遊離 → (ヒドラジン ピリミジン切断) C, T破壊
→ 塩基遊離 → (ヒドラジン ピリミジン切断 / 塩高濃度) C破壊

Ex. PX-174 virus DNA一次構造

a) 2つの遺伝子間にごく短い空間がある場合

        G遺伝子 ------->
        Pro Leu Lys End
     … CCA CTT AAG TGAGGTGATTT ATG TTT GGT GCT ATT …
           リボゾーム結合部位   Met Phe Gly Ala Ile
                                <---- H遺伝子 ---->

b) 2つの遺伝子がごく僅か重なっている場合

        ---------- C遺伝子 ---------->
        Pro Leu Ile Gly Lys Lys SerEnd
     … CCA CTA ATA GGT AAG AAA TCATGAGT CAA GTT ACT …
        リボゾーム結合部位      MetSer   Gln Val Thr
                                <--------------- D遺伝子
卵アルブミン遺伝子

DNA
□ 構造遺伝子部分, ■ 介在配列

DNA複製 (DNA replication)


DNA生合成

信頼度fidelity: 高いがmiscopyもある

突然変異はmiscopyによるものであり、その発生率はその種の存続に関わる問題である
fidelity of DNA > fidelity of RNA

DNAを含まない生物 → RNA virus (RNA上に遺伝情報) ex. TMV
原核生物Prokaryote (bacteriophyta, cyanophyta) → naked DNA
真核生物Eukaryote → DNAとそれと同量のbasic proteins (NHC, RNA) → chromatin structure

chromosomeが分かれている → linkage groupsを作る
Initiation of DNA replication in eukaryote: 複製単位は2n
Eukaryote cellは2n → nuclear membraneから始まるのではないか

DNA合成酵素 DNA polymerase

4種のデオキシリボヌクレオシド-5’3リン酸(dXTP)からピロリン酸を遊離してDNA重合反応を触媒する酵素

DNA修復 (DNA repair)

1) Gilbert
2) 1962 Setlow & Setlow

T–T: UVがあたると*部でT=T結合 (= thymine-dimer)
–T–S*–P–S*–P–S–
T=Tは複製を止めることができる ⇒ enzyme的機能 (光回復酵素)
除去修復 excision repair
--------------------- → --------------------- → ---------------------
-----〇〇___------___-----__-------___----- →→---------
endonuclease____exonuclease_______ligase
(切目を入れる)____(切り出す)
X-rayでdouble strandが切れた時にはこのような機構で修復される

色素性乾皮症 – この修復機構がないために起こる

3) 1967 Gilbert
DNA合成開始
E. coli DNA replication
1) Maaloe et al., Lark

E. coli cell cycle 80%が分裂
合成前にCMを加えると合成が続く。しかし、ずっとCMにつけておくと次の合成が始まらない
⇒ 合成開始と終わりにあるタンパク質合成が必要 = initiation protein

2) 1963 Jacob, Brenner & Cuzm

synthesis
F-factorだけが複製できないことがあるのではないか
E. coliのlac geneをF-factorが取りこんだときにNTG処理

40°C → lac-, 30°C → lac+

常温ではのみ複製してbのようなものが複製されない。つまり複製は別々に行なわれている

3) Replicon hypothesis: 染色体複製の調節機構に関する作業仮説
1963 Jacob & Brenner

synthesis
IG: initiation gene = 構造遺伝子replicon gene
R: replication site
→ replication gene (replicator)
I: initiation gene (initiator)


DNAで特異的なinitiatorが生成され、これがreplicatorにのみ作用して複製が開始されるという仮説

Replicon: 複製の最小単位(1つのIGを持つ) – IGを取り除くと複製できない(致死 lethal)

1963 Cairns: E.coli DNAを3H-thymidineによりradioautography

_______重金属で蒸着(リゾチームのSDSを使用)
synthesis
測定長1400 nm (理論値1360 nm)。開く速度20-30 μm/sec

1973 van't Hoff et al.

pea callus: 18 μm ↔ seedling roots: 38-42 μm (late S phase), 53 μm (early S phase)

1974 Blumental et al.

Drosophila: cultured cell = 19 m / (somatic) = 9 μm → cell cycleの時間が異なることによるのか
egg (high DNA activity) = 2.6 μm: cultured cell S期 10 hr
egg. S期 3.7 min (initiation pointsが多数あればよい)
→ 可能性として、小さいreplication siteが多数ある → initiation site
synthesis
今までは(b)をreplicon sizeとしていたが実際は○1つ1つが(a)ではないか

Sea urchinのhiston

synthesis
サブユニット一つ一つが単位。従って6500/5 kbpが転写開始点

半保存的DNA複製 (semi-conservative DNA replication)

1957 Delbrueck & Stent: 半保存的複製機構の解明

Hypotheses: 1) conservative, 2) semi-conservative, 3) dispersed
synthesis
____________________conservative

1957 Taylor JH

Vicia faba root tip

1957, 58 Meselson & Stahl: DNAの半保存的複製実験的解明
  1. E. coliを重窒素(15N)を含む培地でDNA塩基に15Nが十分入るまで培養
  2. この15Nを含んだ大腸菌を14Nを含む(15Nはない)培地に移し適当な時間培養
  3. 適当時間培養し、そのDNAを抽出し、これを塩化セシウムCsCl 溶液(6 mol 比重1.7 g/cm3)にいれ遠心分離にかける(density gradient centrifugation 密度勾配遠心法 density label)。すると、15N-DNA(15Nのみ)、15N14N-DNA(15N, 14N混合)、14N-DNA(14Nのみ)はそれぞれ自分と同じ密度のところに集まる

結果
synthesis
考察
synthesis
15N14Nが15NDNAと14NDNA鎖からなる証明
1) 2重鎖のDNAを100°Cで30分ほど処理し一重鎖に分離させる
2) この一重鎖を遠心分離で分けると明瞭な2本の帯に分かれる

1960 松岡: Chlamydomonus (eukaryotes), 1961 Simon: Hela cell

共にDNA取り出しsemi-conservative replication指示

1967-1970 Inman
1967 Albert

synthesis ⇒ cellurose: タンパク質付着 - それを調べる
3.5 × 104 daltonタンパク質(ssb91)発見
= ss DNAとよく結合 → ssをds化するもの?
ssb 91が異常だとds DNAが合成されない
super-coilしているものが複成のときに開く → neckを入れることも関与
enzyme → nuclease活性が考えられる

タンパク質の存在理由

  1. 保護protect: DNA周囲について切断等を防ぐ
  2. 酵素: nuclease - Super coil and relaxec circular DNA
super coilしているものが複製のときに開く → neckを入れる、nuclease活性
  1. untwisting topoisomerase: super coilをほどく。E. coliのW-protein (= DNA binding protein)
  2. twisting topoisomerase = gyrase: α – Nal A 48 gene, β – Cau 82 gene → twistを作る
1966 Okazaki (岡崎令治, 明大) – 広島で被爆し白血病で死亡

3H(14C)thymidine → 加熱後急冷denature (H-bondを切る) → ショ糖密度勾配 → 遠心

岡崎仮説 = Discontinuous DNA replication
  1. 親DNA鎖がほぐれ、その後+鎖–鎖上で短DNAが共に5' → 3'方向に合成 (a: 可能, b: 不可能)
  2. 短いDNA断片(岡崎断片Okazaki fragment or piece)が別な酵素により繋ぎ合わされていく
  3. 新しいDNAはどちらも5' → 3'の方向に短い断片として合成され、他の酵素により結合される
Okazaki

ligase less mutant → 断片DNAのまま

1967 McKenna & Masters

Okazaki 74上にilr gene (A B C)確認: ここから遺伝子複製開始
Okazaki

1968 Dressler & Gilbert: Rolling circle hypothesis

PX-174-typed E.coli
部分的 double strand
Okazaki
single strand_______**RNA__RNA合成___DNA__Replication form
__________________ polymerase

BP*: (single strand) binding protein - 切断を防ぐためDNAの周囲にタンパク質が付着
RF-1: ポリペプチド終了因子

これが再び輪を作りsingle strandとなりまた複製をする → 環状1本鎖は回転する

OkazakiOkazaki
DNA構造_________塩基対の対合がとれ一本鎖となる
Okazaki
A, T, C, Gの4種類の塩基を持つ。デオキシヌクレオシド3リン酸がピロリン酸([P~P])を切り離して、その時のエネルギーで相補的に結合していく。DNAポリメラーゼが触媒として働く
Okazaki
新しく作られた鎖体は古い鎖とまったく同じ塩基配列を持つ

複製 (replication)

DNA複製の場所 (sites for DNA replication)
仮説: Eukaryotes細胞は2n → nuclear membraneから始まる
1973 Huberman, Tsai & Deich

30" labelで核中に全放射能が分布 → 合成されるものが膜についているとは限らない
condensed heterochromatinがあり、それまで膜で合成されていると思われていた部分はheterochromatinを合成しているときを観察したものと思われる
核膜付近でDNA合成がなされているというのは否定的

1976 Sparvoli, Galli, Mossa, & Paris 1974 Berezney & Coffy, 1976 Kelly & Riley, 1978 Miller, Huang & Pogo

isolated nuclei(核膜の外側を除去)
1% Triton × 100, low Mg, conc., light salt (2 M NaCl), Dnase Iで処理 → 遠心 → 沈殿

replication

internal fibrogranular network: acidic proteins + RNA + lipid + (DNA) ⇒ 核のnetworkが合成の場

Def. タンデムリピート (縦列反復配列, tandem repeat): 縦列に反復コピーされた遺伝子が並ぶ配列

gene ↔ 非遺伝子DNA

コット解析 (cot analysis)
DNA再会合に関する変数, Cot = Co (DNA濃度, concentration) × t (time)

Ex. 50%再会合する場合をCot1/2と表現 → 大なら反応が遅い
⇒ DNA濃度分析可 (現在使われていない)

細菌DNA複製 (replication of bacterial DNA)
Double strand is a factor of protein, perhaps RNA
Circle: いくつかのループとなる → 集まって核様体nucleoid形成

replication

1960 Lima-de-Faria: アイソトープを与える時間を短くしpulse label → 各所でDNA合成
1963 Cairns: DNA fiberの中に各点で複製があることを示す
1968 Huberman & Riggs

各データ比較し複製開始点をpin pointで示す
replication

バクテリオファージDNA複製
一本鎖DNA (+)
宿主侵入 → +鎖上に–鎖作る → +鎖と–鎖が解け新しい鎖(+に–、–に+)作られる
+鎖のみが子ファージに入る(–鎖は複製時のみ活動し子ファージに入らない)

一遺伝子一酵素説 (one gene-one enzyme theory)


1930' Beadle & Efrish
Morganの所でDrosophila研究により既に一遺伝子一酵素説の考え方を持っていたが材料が複雑で証明難しく材料をアカパンカビに変える
1941 Beadle & Tatum (BeadleはMorganの弟子)
遺伝子 → 酵素 → 形質
「一つの遺伝子は特定の酵素の形成を支配し、その酵素の働きによって特定の形質が発現する」
1) 野生型アカパンカビにUV → 突然変異種(栄養要求性突然変異株)

最少培地: 野生型がやっと生活できる必要最小限の養分を加えた培地
完全培地: 突然変異種でも生活できる様々な養分を十分に加えた培地

2) 栄養要求性突然変異株の整理

I: 最少培地 + Arg, Cit、Ornのうち1つを加える → 生存
II: 最少培地 + Arg, Citのうち1つを加える → 生存
III: 最少培地 + Arg → 生存
(アルギニン合成過程はオルニチン回路と同じ反応経路と仮定)

        Glu  →   Orn →   Cit →   Arg →
             ↑       ↑       ↑
          酵素I    酵素II   酵素III  酵素を介した生物体反応
        遺伝子I  遺伝子II 遺伝子III
    I     –        +        +        酵素I遺伝子が突然変異
    II    +        –        +        酵素II遺伝子が突然変異
    III   +        +        –        酵素III遺伝子が突然変異

一処理で多数の個所が変異する確率は極めて小

1951 Beadle GW (Beadle, Tatum EL & Lederberg J. 1958 ノーベル賞)
一遺伝子一初期機能仮説 「遺伝子はそれぞれ1個の初期機能を支配し、その中には酵素以外の他の生化学的な因子の形成をも含まれる」
Ex. Drosophila眼色に見られる遺伝子の酵素支配
one gene-one enzyme

バーミリオン: V遺伝子突然変異 →

酵素V作用せず色素形成がそこで停止 → 朱色眼

シンナバー: Cn遺伝子突然変異 →

酵素Cn作用せず色素形成がそこで停止 → 辰砂色眼

スカーレット: St遺伝子突然変異 →

酵素St作用せず色素の形成がそこで停止 → 緋色眼

Ex. カイコ眼色異常
1906 外山亀太郎: カイコの遺伝の研究
第一白卵: キヌレニンを変える酵素が変化し作用しなくなったもの
第二白卵: ヒドロオキシキヌレニンを変える酵素が作用しなくなったもの
トリプトファン →a キヌレニン →b 3-ヒドロオキシキヌレニン →c 褐色色素

a: ここの酵素が作用しない異常個体は出ていない
b: 酵素I
c: 酵素II

1941 吉川秀男: カイコ眼色異常発見。一遺伝子一酵素説発見の契機
正常: 黒眼藤色卵、異常: 白眼白色卵
人の物質代謝異常
一遺伝子一酵素説で説明されるもの
遺伝子が突然変異を起こし、ある酵素が作用しなくなり、中間物質が蓄積し異常が生じたもの
フェニケルトン症: フェニルアラニンをチロシンに変える酵素(フェニルアラニンヒドロキシラーゼ)の異常。フェニルアラニンが蓄積し、正常経路で分解されずフェニルピルビン酸となり尿中に出る。肉体的、精神的(白痴)異常。常染色体上にあり劣性ホモで出現
アルカプトン症: アルカプトンをアセト酢酸に変える酵素の異常。アルカプトン蓄積し尿中に出る。アルカプトンはアルカリになると酸化され黒変し、黒尿症ともいう。健康にあまり影響しない。常染色体上にあり劣性ホモで出現
白子(アルビノ): チロシンからメラニン色素が形成されていく過程で働くチロシナーゼが異常。弱視などを伴うことがある。常染色体上にあり劣性ホモで出現
その後 ...
酵素は複数ポリペプチド鎖から構成されるものがある → 遺伝子は複数
遺伝子は酵素だけではなく構造タンパク質もコード
⇒ 一遺伝子-一ポリペプチド鎖(説)というべき

リボ核酸, RNA (RNA)


構造: リボース + リン酸 + 塩基(ACGU)のヌクレオチド
結合様式はDNAとほぼ同じで糖–リン酸を主鎖とする鎖状構造
  • mRNA (messenger- RNA, 伝達RNA): 一重鎖で分子量5-50万。DNA塩基配列を写し取りリボゾームへ運ぶ
  • tRNA (transfer-RNA, 運搬RNA, アミノ酸転移RNA): 80個位のヌクレオチドからなりMW 2.4-2.6万。1本鎖が真中から折れ曲がり2重螺旋をなす。リボゾームにアンチコドンの塩基配列により特定のアミノ酸を運ぶ
  • rRNA (ribosomal RNA, リボゾームRNA): タンパク質と結合しタンパク質合成の場であるリボゾーム構成。RNA全体の70-80%占める

    遺伝子検査: DNAよりコピー数多く高感度検出に利点

RNA生合成

1955 Ochoa S

Polynucleotide phosphorylase: n·ppB (5'側にppがついている) ⇔ nPi: Mg++必要
生成物がRNase sensitive。3'-5' phosphodigester
RNA as primer: 結果的にRNA鎖延長を行う。しかし、RNaseは延長よりも逆行の方をよく行う

1961 Hurwitz (E. coli)
1961 Weiss (E. coli)
1961 Stevens (Microsoccus lysodeiktics)

⇒ 3人ほとんど同時に発見
RNA polymerase = DNA dependent RNA polymerase
n·pppB ⇔ (pB)n + nPPi: Mg++必要
DNA as template, no primer - complementary

1962-64 Weiss, Stevens

RNA replicase: n·pppB ⇔ (pB)n + nPPi
RNA as template, viral RNA 5' → 3'

1964 Smellie: 体内でのバクテリア酵素の役割確認
1966 Spiegelman, 1966 Haruna

RNA virus (プラズモウイルス) → [酵素] → RNA viral RNA (active): 細胞に感染増殖

mRNA


ファージmRNA: 全構造解明されている例多

MS2(f2, R17)全構造: 1RNA, 3569残基
Code: degeneracy in single protein, coat protein = 50 codons, A protein = 61 codons
二次構造

前核細胞mRNA

leader-codon-tail-polyA

真核細胞mRNA

Cap構造: 5'末端にある。TailにpolyA存在 – eIF3でCap結合タンパク質がmRNA認識のために必要
m7G → mRNA·43S → mRNA·80S
※ ウイルスmRNAは真核生物と同一

安定化 mRNA (stable mRNA)
1963 Tyler: ウニsea urchinのunfertilzed eggを20分間酪酸処理

→ 2分 = 有核のものと無核のものができる → 両方とも発生進む ⇒ stable mRNAの存在

1964 Gross: ウニにactinomycin-D処理を行いmRNA合成を阻害

→ タンパク質合成は継続された → stable mRNA存在
cf. 赤血球核は早々に消失するが合成は連続的である ⇒ long-lived mRNA存在期間が特に長いため

1964 Spirin AS et al.

8細胞期: 14C-leusine (タンパク質に入る)と3H-uridine (RNAに入る)を取りこませ追跡
遠心分離しcytoplasmを調べた
mRNA
Polysome: mRNAの合成されている証拠
mark: free mRNA, protein partiles = 情報粒子informosomes
各々のRNAピークをとってショ糖遠心等を行うとタンパク質がとれる = mRNA-protein complex

mRNA–polysomeの関係
1. Reverse
1965 Henshaw: CsClで固定したpeakパターン → complexである
mRNA 1971, 1972 Weber MJ et al.

Animal cultured cells
OP culture: high temperature: labeled mRNA

Cf. mRNA labeled by actinomycin-D = 0.5 μg/ml – rRNAだけを阻害, 5-10 μg/ml – 全てのRNAを阻害
したがって、薄いact-Dで他のRNA合成を阻害して3H-labelを行えばmRNAだけをlabel可能

mRNA
→ heatにおいて温度を平常にするとcontrolと同じ曲線となる
mRNAの周辺を様々なタンパク質が取り巻き、様々な要因となっている

1966 Duro III & Stake: ワタの種子中の胚

conserved mRNAを確認 = 乾燥種子中にmRNAがあることの実証

1968 森・伊吹・松下

ダイズを水につけ吸水させた後、ホモジェナイズして遠心後にS100を集めショ糖密度勾配にかえる
mRNA
*: RNA-protein complexとして種子中に存在

RNA一次構造決定法

1965 Holley: yeast tRNAAla
1976 Fiers: bacteriophage MS2 - 3569 bases

RNA → DNA: 逆転写酵素(DNA primary structureを決定しRNA primary structureを判断する)

1) 未標識RNAを使用する場合 (unlabelled)
a) 酵素を用いて加水分解:

RNase T1 = -Gp∧, RNase A = -Pyp (-Up∧ or -Cp∧) (∧: cut)

b) 加水分解産物分離:

2次元展開 y方向 = paper chromatography, x方向 = 電気泳動

c) Oligonucleotideの加水分解・分離
i) enzymes

Pnase: -pNpN'p∧N'' → pN∧pN'
nuclease SW: -ApB∧pC∧p - X∧pY∧pZ∧p
PNPaase

ii) chemical reaction: アルカリ分解, or 過ヨウ素酸分解 (NaIO4)
d) 配列決定

oligonucleotide (DP small)
Ex. RNase T1 … XpGp
XpYpGp → XpYpG → X + pY + pG
______PMase___PDase

e) mapping
2) Sanger method (1965)

タンパク質合成 (protein synthesis)


タンパク質: 生態内では常に合成と分解の動的平衡状態にあ るdynamic equilibrium

アミノ酸 → (タンパク質合成) タンパク質 → (タンパク質分解) アミノ酸
Ex. 血清アルブミンの半減期は17-20日

DNAの遺伝情報はいつも全てが活動しているわけではない。一部は活動が停止されているのが普通
1957 Click

一般原理 central dogma: DNA遺伝情報がRNAを経てタンパク質に発現される (DNA依存RNA合成)

オペロン (operon)

酵素合成誘導: 一般に分解過程に関する酵素に見られる

E. coli: ブドウ糖をアルコール発酵により分解し生成するATPを利用する
乳糖のみを含む倍地に入れると約14時間経ってから乳糖を利用できるようになる → 乳糖が与えられると乳糖を分解するラクターゼ(β-ガラクトシターゼ)が約14時間で合成され、この酵素により分解される
誘導酵素: この場合β-ガラクトシターゼ
誘導物質: 酵素合成を誘導する物質。この場合乳糖(類似物でもよい)
1) 既に酵素を合成する遺伝子が存在する
2) 誘導物質が存在する

酵素合成抑制: 一般に合成過程に関する酵素に見られる

E. coli: ブドウ糖とNH3があればアミノ酸を合成するが、すでにアミノ酸(トリプトファン等)を加えた倍地では合成を抑制してしまう ⇒ すでに最終産物があるときには生成過程を抑制させる

1961 Jacob & Monad (1965 ノーベル賞)

オペロン説 operon theory
operon
オペロン =
構造遺伝子: 酵素合成を直接支配。数多くあり構造遺伝子群をとる
作動遺伝子(オペレーター): 構造遺伝子(群)の一端にあり構造遺伝子の活動を左右する
調節遺伝子: 遺伝情報の発現を調節する ⇒ 調節物質作る。DNAの別な場所にある

トリプレット説 triplet

1950's Coldwell & Hinshelwood

タンパク質のアミノ酸配列が核酸の構造単位の配列により決められると考えた

1952 Dounre: タンパク質合成がmRNA鋳型上で起こることを提唱
1953 Watson & Click: 2重螺旋構造の発表
1954 Gamov G (Mathematician, Physician)

DNAの塩基配列とアミノ酸(aa)配列が対応すると仮定すると、塩基はAGCU(T)の4つからなるので
41 = 4: 1つの塩基がaaを決めた場合
42 = 16: 2つの塩基がaaを決めた場合 - aa数(20)より小さい
43 = 64: 3つの塩基がaaを決めた場合 - 全aaを作るのに十分
3つの塩基配列が1つのアミノ酸を決定すると考えた
⇒ 重複型トリプレット説: 2個づつオーバーラップしながらアミノ酸を指定する暗号となっている
トリプレット triplet: 3個の塩基配列

1955 Ochore S (1959 Novel Prize)

ヌクレオシド2リン酸からリン酸を離してRNA合成酵素を発見し、それから単ポリマーの合成に成功

1957 クリック: 非重複型トリプレット説

重複型は1塩基配列が決定されるとその前後のアミノ酸配列が制約を受けるため不自然

  1. 遺伝暗号はトリプレットで非重複型
  2. 64通りのトリプレットコードtriplet codeのうち20通りがセンスコードで残りはナンセンスコード
  3. コードとコードの間に句読点はなくてもナンセンスコードがあるので正しいコードだけ読める
1961 Nirenberg N (1968 オチョアらと共にNovel Prize)

[実験] E. coliを使い無細胞タンパク質合成系作る。この合成系に擬似mRNAとしてポリウリジン(-U-U-U-U-…)を加えるとタンパク質合成のためにフェニルアラニンが選択的に取り込まれた
[結果] mRNA: …-U-U-U-U-… → ペプチド鎖: フェニルアラニン-フェニルアラニン-フェニルアラニン
[考察] ポリUがフェニルアラニンの暗号(トリプレットUUUがフェニルアラニン暗号となることは後に実験証明)

1962 Nasse & Nasse, 1963 Swift et al.: DNA fiberをEMにより確認観察

Mammal, sea urchin, Drosophila: 5 μm
Yeast: 20-26 μm
Higher plants: 5-30 μm, 60-70 × 106

1965 Khorana HG

[実験] 混合ポリヌクレオチド(混合ポリマー)によるアミノ酸コードの決定

    DNAにあたる    …TTCTTCTTCTTCTTC…
    mRNAにあたる   …AAGAAGAAGAAGAAG…
    [結果]
    合成ペプチド鎖 …LysLysLysLysLys…
                    …ArgArgArgArg…
                     …GluGluGluGluGlu…

[考察] 3つの塩基配列が1つのアミノ酸を指定する決定的な証拠となった
→ 2あるいは4塩基が暗号となっていれば暗号が何種類かになるので単独ポリペプチド鎖はできない
以後盛んに暗号解読がなされ1968年までにほとんど完成した

mRNA遺伝暗号 genetic code (コドンcodon)
同じアミノ酸に対する同義的暗号がある = 3番目の塩基は変化しても同じアミノ酸を指定することが多い
開始コドン initiation codon: AUG (メチオニン),GUG(バリン)

ホルミルメチオニンはタンパク質合成開始暗号で合成後ポリペプチド鎖から外れることがある

終結コドン termination codon: UAA, UAG, UGA

読むのはタンパク質であり、これを読む特定t-RNAがある訳ではない(virus → 停止暗号2つ続くとタンパク質合成停止)

※ この遺伝暗号は地球上の全生物で同じ
     1番目           2番目        3番目

    (5'側)    U    C    A    G   (3'側)

      U      Phe  Ser  Tyr  Cys     U
             Phe  Ser  Tyr  Cys     C
             Leu  Ser  Term Term    A
             Leu  Ser  Term Trp     G
      C      Leu  Pro  His  Arg     U
             Leu  Pro  His  Arg     C
             Leu  Pro  Gln  Arg     A
             Leu  Pro  Gln  Arg     G
      A      Ile  Thr  Asn  Ser     U
             Ile  Thr  Asn  Ser     C
             Ile  Thr  Lys  Arg     A
             Met  Thr  Lys  Arg     G
      G      Val  Ala  Asp  Gly     U
             Val  Ala  Asp  Gly     C
             Val  Ala  Glu  Gly     A
             Val  Ala  Glu  Gly     G

Term = 終止コドン
Met = 開始コドンにもなる

開始機構 initiation
読み始め因子: IF1, IF2, GTP (IF1, IF2: 生体内mRNA → Proteinに必要)
1968 野村真康: 15N-a.a.: D2O中でE. coliを培養

(分子サイズ、電気的特性等の問題は多)
→ ribosome抽出: labelingされていること確認
14N中で培養後リボゾーム抽出分離
→ 何型のリボゾームが作られているかを調べる
70S ⇔ 30S + 50S

翻訳 translocation

Shine-Dalgarno box: AGGAGGU → 30SとmRNA結合のためAUG上流にある
塩基配列、結合(挿入)のメイン部位は16S
読み終わりはDNA replicationのときと同じ

[GTP数]
elongation: EFTu + EFTs = GTP1分子/ペプチド結合
translocation EFG: GTP1分子/ペプチド結合
extra GTP: mRNAのreleaseに1分子、その他?

原核生物(E. coli)タンパク質合成系
  • IF1 (分子量 8119): 70Sの解離
  • IF2 (90000): 70S上でGTPase。FMet-tRNAFの30Sへのbinding factor
  • IF3 (20668): 天然mRNAのrecognition factor。30Sへの結合。多数の分子種。抗会合分子
  • IF1 + IF3: 70S-AUG-FMet·tRNAF complex生成
mRNAを結合したリボゾームにAA-tRNA complexが近づき相補的塩基配列を持つものが結合し、そこでペプチド結合によりペプチド鎖を作る。一度に入れるのは2文字分(塩基6個分)。ホルミルメチオニンをつけたtRNAがP部位についてから、次にうまく結合できる。アミノ酸tRNA complexがA部位に入る。この様にしてmRNAを開始点から終始点まで移動してペプチド鎖を伸ばしていく

protein synthesis 成長しつつあるポリペプチド鎖: 末端tRNAでタンパク質合成部位につないでいる。(1)成長しつつあるカルボキシル末端には常にtRNA分子がついている(N末端→P末端に合成)。この末端のtRNAがP部位またはA部位に結合することが、成長しつつあるポリペプチド鎖をリボゾーム上に保持する主な力となっている。 protein synthesis

水素結合による特異的アミノアシルtRNAのn + t番目コドンの結合: この反応には成長因子TとGTPが必要。(2)ペプチド結合ができると成長しつつある鎖の結合場所はP部位からA部位に入る。(3)ペプチド結合の形成と同時ではないにしても、直後に自由になったtRNA分子はP部位から放り出される。

GTPのエネルギーを使っている

protein synthesis
ペプチジルトランスフェラーゼ(PT)によるaa2とaa3間のペプチド結合の形成: この酵素は50Sサブユニットを構成するタンパク質の一つである。tRNAのP部位からの遊離

protein synthesis
成長しつつあるポリペプチド鎖のついたt-RNAのA部位からP部位への転移: この反応には伸長因子GとGTPが必要。(4)新たに末端になったtRNAが次にA部位からP部位へ移動(転座tranlocation)。同時に小さい方のリボゾームサブユニットに結合しているmRNA鋳型は以前のn番目のコドンで占められていた場所にn + 1番目のコドンを持ってくるために移動する。
同時にmRNAが移動しn + 2番目のコドンがA部位にくる。(5)こうして空になったA部位はいつでも新しいAA~tRNAの特異性(次ぎに何が来るか)は、mRNA中のコドンとtRNAアンチコドン間の正しい塩基対で決められる。
完成したポリペプチド鎖は、普通最初のホルミルメチオニン部分を切り離し高次構造が作られタンパク質が完成する。

真核生物タンパク質合成系
(E. coliとほぼ同じ) ただし、eIF種類多: cap認識等の調節が多い
ATPがinitiationエネルギー
eIF5: 40S粒子と60S粒子を結合する酵素。リボゾーム上での因子ではない
  • eIF1 (15K): 48S initiation complexの安定化
  • eIF2 (122K): Ternary complex形成。40Sへmet-tRNAF結合
    α (32K): ±P (protein kinaseで) +Pで阻害
    β (35K): 因子全体の安定化?
    γ (55K)
  • eIF3 (700K): Rabbitでは9 subunits
    (35K, 39, 43, 49, 69, 110, 130, etc.): 40S-eIF3, 4C complex形成。リボゾーム選択。MRNA認識と43 initiation complexへの結合?
  • eIF4A (50K): 43S initiation complexへのmRNA結合
  • eIF4B (80K): Cap-cap結合タンパク質の認識
  • eIF4C (19K): 40S complex形成。48S initiation complexの安定化
  • eIF4D (17K): 80S initiation complex?
  • eIF4E (24K): Cap結合タンパク質。43S initiation complexへmRNA結合
  • eIF5 (125K): 48S-60S joinase、AUG認識
  • eIF6 (23-25.5K): 40S + 60S dissociation
  • Co-eIF2A, B, C (20K, 450K, 200K): eIF2の補助
読み取り開始

↓ eIF2 + GTP + Met-tRNA|Met
[Met-tRNA|Met&mdidot;eIF2·GTP]
↓ 40S小亜粒子
[40S· Met-tRNA|Met·eIF2·GTP]
↓ mRNA
↓ 60S大亜粒子
↓ eIF4A, eIF4B, eIF4C, eIF4D, eIF5
[80·Met-tRNA|Met·mRNA]

アンチセンスRNA
mRNAに対し相補的な配列を持つRNA
アンチセンスRNA細胞内に存在 → 相補的mRNAと結合しタンパク質への翻訳阻害 ⇒ 遺伝子発現抑制
[利用] 細胞内合成されるタンパク質量を減少させ望ましい形質への形質転換

Ex. イネ: 米粒中に含まれるアレルギー原因タンパク質の生成を抑制

遺伝子発現 (gene expression)


遺伝子発現過程 process of gene epression

  1. 遺伝子の再編成
  2. 転写
  3. RNA合成
  4. 翻訳
  5. タンパク質の修正
分子生物学molecular biologyの方向: 細胞分化と体制化の問題 / 脳など高次神経系の問題

古典遺伝学 classic genetics

野生型wild type → [変異剤 mutagen] → 変異型mutant type
酵素変異による変異型: 不活性または生産されない

なぜこの酵素がダメになったのかをbiochmical assay用い調べる = その酵素の発現機構調べる

→ 自ずと変異株の種類が限られてきて最終的に全ての発現機構を明らかにすることは不可能に近い

改変遺伝学 reversed genetics

遺伝子工学 gene engineering = 遺伝子操作 gene manipulation
I. I. シグナル認識物質の同定 identification of signal DNA sequence
II. 細胞の種類
Basic transcriptive function
=============== DNA signal: utilized heterogenous cells
Regulatory function
-------------------------- cell that expressed, per se
┉┉┉━━┉┉┉=====▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉
___________________________________endogenous, exogenous
┉┉┉━━┉┉┉=====▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇▇┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉
____________________________
異なる遺伝子を入れておけばendogenousかexogenousかがわかる
→ しばらくすると核内のクロモゾーム中に取り込まれていくが、取りこまれる場所は定まっていない
細胞質を使った研究はここまで - 遺伝子領域まで決定できる方法ではない
_exp. 3_exp. 1__________endo._exp.2
--███--//--░░░-███--░░░--//--███--//--███--░░░-
_b______L____i_____j______m______ q____r
_5 or 0__ 5___ 20___15_____100 (unit) 35___20

███ wild type, ░░░ mutant

取りこまれた場所によってwild typeでも発現量異なる。Mutantを取りこませたとき、それが場所によって発現量が減少したのか、遺伝子を削ったために減ったのかを判断するのは困難
なぜ取りこまれる場所によって発現量が異なるのか、取りこんだ遺伝子の外側領域の遺伝子を取り出してcloningし外側領域の塩基配列を決定していく。取りこみ完了細胞を1つの初期胚に取りこませ発生過程を経過させる
III. 受精卵 fertilized egg
reversed genetics mouse/Drosophila

取りこまれた遺伝子は発生段階を経て脱落してしまうか、また取り残されている場合、どの細胞でどれ位の量が発現されているかを調べる → test of regulated expression → identification of signal DNA sequences

Findings of the component responsible for the regulated function
ある遺伝子マーカーに異常のある生物を異常のないものに入れ換えることによりその生物を救える

= gene rescue
遺伝子が付加的に入り込んで来たとき、その生物体にどのような変化が見られるか

ゲノム編集

特定の遺伝子配列を特異的に認識するシステム
TALE-Nuclease
CRISPR-Cas9
guide RNA (rRNA, tracrRNA): 相補的配列を含み標的配列に結合するRNA
Cas9: guide RNA に結合し標的配列を切断するタンパク質

分子発生生物学 (molecular and developmental biology)


1968 Brown (1969 鈴木): Xenopus laevis, ribosomal RNA genes

specific gene amplification in oocyte → DNA-RNA hybridization

  1. これだけcopy数が多いと生化学的手法で遺伝子をisolationできる (Birnstiel et al. 1969, Gall 1969)
    100% genome DNA + 100% rDNA = 50% purification
  2. 細胞分化cell differentiationの一端を伺い知るものとなる
    細胞が分化するということは、ある遺伝子を予め増やす機構のお膳立てができる
    type cell: 70-75% = rRNA (18S + 28S), 15-20% = tRNA, 5% = mRNAs, hnRNA, snRNA, ssRNA
    tRNAを100% pure努力行ってきたがrRNAに比べ極めて困難 ↔ rRNAを100% pureにするのは容易

    tRNAは数10種類のものがあり、1種についての遺伝子サイズが小さすぎる

(Suzuki & Brown 1972)

Isolation of sil fibroin mRNA
Finger print
Use DEAE-Sephadex

finger print 4つのピーク: 理論的にはIVのピークが消えたグラフとなる
→ pure mRNAが得られたと考えて良い(純度90%)
→ 単離して調べる

XG: Gly3番目ヌクレオチド = UG > AG > CG、CYG
___ Ala3番目ヌクレオチド = CUG > CAG > CCG
⇒ 遺伝暗号の比率がわかる

Detection of fibroin genes
1972 Suzuki, Gage & Brown
1887 Boveri: Parascaris equorum

____2 cells period________4 cells period
__中期_______終期
体細胞運命 chromosome
finger print
体細胞染色体は成長段階で不必要な部分が切り捨てられる
体細胞染色体(genomeの20%捨てる)と生殖細胞染色体(遺伝子)を比較
Hypridizationによる比較の問題点 → 全細胞で同じ結果を得る
1つのnucleotideが変化したらどうなる Ex. 機能消失 → 種分化へ応用

(Suzuki & Ohsima 1977, Ohsima & Suzuki 1977)

Isolation and characterization of fibroin gene
finger print firroin gene - 0.004% of the genome
Bombyx mori 2.5 × 10-5 = 0.52 pg (cloning容易)

General ~ × 10-6 = 3 pg (ex. mouse)

Act-D/CsCl (Act-D: Gに付着し比重が軽くなる): geneを短い断片にしてこれをcolumnにかける
Gを多量に含むgene → firboin gene
これを抽出すれば濃縮可能 1000倍濃縮 純度0.4%

→ cloning ⇒ 転写開始末端必要 = より長い遺伝子鎖gene chain欲しい
finger print ⇒ 7/10000の頻度でfibroin geneがとれる
転写開始部のある長いgeneをとる

cloning Cloning法: E. coli中にplasmid (vector)移入し、それをCM中へcultureするとvector geneだけが最大1000倍程度に増殖
遺伝子構造解析 (structural analysis of the genes)
1981 Busslinger, Moschonas & Flanell

21 bpのところにmutation[normal = G, β+ = A]
始めの転写速度が遅い β+ matureなmRNAにsplicingできない

ex. 1______int. 1_____ex. 2
▓▓▓▓▓▓▓░░░░░░░▓▓▓▓
______________┃┗━━━━━┓
_______________C*CCT*T*A*G*
___________┗━━━━┓
___________C*TAT*T*GG* - normal
___________C*TAT*T*A*G* - β+

Intron 5'末端や3'末端の遺伝子が異種でも混在conserveされる。GがAに換わるとintron 3' siteとの類似性高くなる。本来intron 3' siteはexon 1の3'末端を見分ければよいが誤って21 bp付近を認識する可能性高

1979 Tsuda, Ohsima & Suzuki

Transcription initiation
SI mapping method: initiation pointを決定する方法

実際の転写開始の信号 (ex. AGT) = promoter

Hybrids arrest = ex. 数の少ないmRNAのクローン

抗体でpolysomeを落としmRNAをとる。しかし、この時期のmRNAも同時に取れるがそのままcopy DNAを作らせる → 調べるとintronのないものもある (ex. histone H1, H2A, H2B, H3,H4などには無い)

生体外翻訳系利用 (use of in vitro transcription system)
Type I gene =
ETS (external transcribed sequence)
ITS (internal transcribed sequence)
Coding region

Unique geneでなく、この3つを単位にNTS (non-transcribed spacer)となり転写されない。r-RNA large unitになる25-28Sの方はintronがあるがsmall unit r-RNAの方にはない。Drosophila melanogasterでは2500, 1200のcoding region間に50% 500, 1000, 5000のintron、15% 3000, 4000のintron、35%の非イントロンがある 反復配列repeated sequence: 長さ不均一 → NTS長変化

Type II gene: modified RNA polymerase II genes
Posterior silk gland extract (Tsuda & Suzuki 1981)

promoter
___AとBは同じ
比べるもの同士を1本の試験管に入れると +514: A >> B (dominance assay or competition assay)
重要なものが不足する。Wild typeのAがその重要なものを強引に取ってしまう
-238____-116____-73_____-53___-29_________+6
---|▓▓▓▓▓|------------|▓▓▓▓▓▓|-------|TATA__|▓▓|▓----------------
_______________________________↘ promoter
__________ここが存在するとpromoter activityが一段と強くなる
ここが存在するとpromoterの活性がさらに一段と強くなる

= enhancer-like element ⇒ enhancer element (DNA) → SV40, plyoma etc.に似た性質がある

    P.S.G. cell    Fibroin gene   Sericin gene
    後部絹糸腺         +++              –
    中部絹糸腺          –              +++

Ad geneはHela extractで良く発現 ↔ PSGではそれ程でもない
B regionの働きはHela extract中で見られるがPSGで見られない

        Hela                PSG
        Ad   Fib  Globin    Ad   Fib  Globin
        ▅▅▅▅                ▂▂▂▂
             ▅▅▅▅                ▅▅▅▅
                  ▅▅▅▅                ▁▁▁▁

hnRNA → (processing) mRNA = 初期転写産物 primary transcripts

一般的特性

0. exon- intron
1. exon-intron junction
2. non-translated region (GT-AG mule)
3. promoter: 酵素の転写開始認識部位

リプレッサー repressor: DNAのプロモーター近傍に位置しオペレーターに結合し遺伝子発言を抑えるるタンパク質性転写調節因子
⇔ アクティベーター activator: リプレッサーと逆の役割

1) Exon-intron junction: IntronのGT-AG mule
Phaceoline (タンパク質)
        Exon  Intron	       Exon
          →→→  ↔↔↔↔↔↔↔↔↔↔↔  ←←←
        A … CAT  GTAAG … AG  G …
        B … AAT  GTAAG … AG  G …
        C … GAG  GTAAT … AG  G …

Intronの最初はGTで最後がAGになるもの多 Ex.chicken avalbumen gene, rabitt α globulin gene, mouse b globulin geneは全てこれに従う

2) Pormoter
原核生物ではprobnow box (prokaryotes promoter)が知られる
“TATPuATP”配列。真核生物ではこれに対応するものがGoldbery-Hogness (TATA) boxと呼ばれる。これらの信号のあと原核生物では5-6、真核生物では29-35塩基後に転写開始点initiation pointがある。KB cell (Reader 1979)とHela cell (Marley 1980)でin vitro転写(DNA → RNA)可能(Reader 1979) – 転写開始点が明確になったことによる

de in vitro: analysis of product
in vitro: 1979 Roeder BがKB cells, 1980 ManleyがHela cells
in vivo: Birknstiel Xenopus eggから抽出された酵素

1980 Champon

Conalbumin … TATA … → … TAGA … 機能するが効率落ちる

Hypersensitive region

Rabbit β-globlin gene: -40から-100 ⇒ TATA boxより優先される決定因子

Modulator
1980 Brinstel: Sea urchin histone gene H2A

-184 ~ -524: E-region, +1: efficient-beginning position
E-regionが消失し、その後+1の位置に変化が見られる → E-regionはmodulatorではないか

Enhancer (Activator)
SV40 – circular → straight
____72b____72b______21b 21b 21b_____TATA box___mRNA
----░░░░░░░░░░░------██--██--██---------█████------████------
__repeated sequence = enhancer (GC rich)

1. short base sequence
2. cis配位
3. 逆になろうと構わない = 方向性は無関係
4. 隣接している必要はない
5. 活性部位の下流でもよい
6. 活性部位にあるものは何でも良い (T-antiqueの必要はない)
7. SV40をpolyomaに交換可能
repeated sequence consensus = 15 base

Termination signal
AATAAA (poly A): 1000倍 (cf. re =reverse, tr = transcriptase, o = oncogene)
Hetro virus (RNA virus) 60-70S single strand RNA

______R U5____________U3 R___3 (3 primer), 5 (5 primer)
V-RNA ●------------------------------●
_____________↓ reverse transcriptase
_______L-LTR_________________R-LTR
__░░░░████████===========████████░░░░░░░░░
_________________U3RU5_________________U3RU5(polyA)
_____________________この時点ではdouble strand
_________↓ incubation to host
___promoter → mRNA or rRNA

Type III gene
splicingに関するsmall nucleous RNAでキャップ構造を持っていないもの
promoter 1980 Brown D & Sakoyn: Xenopus 5S RNA

Transcription of 5S DNA: ~20000 copies/genome
5S RNAはsplicingされるprecursorないので一次転写産物はすぐ実用できる

1980 Sakonju, Bogenhagen & Brown

"in vitro genetics" proposed by Brown
= reversed genetics (sensu lato) by Weissmann
promoter
これを用いて発現機構を調べる
promoter

次に3’側からcut (Bugenhagen, Sakonju & Brown 1982)
━━━━▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆━━━━━━━ +++
━━━━▆▆▆▆▆━━━━━━━━━━ - (+90までcut)

+51から+90の間に何らかの転写開始要因がある: 遺伝子制御 = control region ≈ promoter
Control regionに:

  1. 何らかのtranscription factor (purified 5S gene specific factor)が結合する
  2. 5S factor/5S RNA complex (7S particle)
  3. Auto-regulation system: 5S factorの量でRNA生産量は決定される
1982 Sakonju & Brown

======================
____↓ DMS
====================== CH3
5S factor bindig
______________+40____+50____+60____+70____+80____+90
non-coding strand ··············································GG···········GGATGGG···
coding strand____----------------------------------CC--------CCTACCCG---
_____________________↓ 5S RNA______________________+91
_______________----------------------------------GG--------GGATGGG----
Gを阻害(= methylation)

1982 Bogenhagen, Wormington & Brown

-------████------- + nuclear extract (5S factor + histones)
______↓ complex
transcriptionally inactive

1981 Burnsteil: t-RNA = split promoter

left____GGTCTAGTGG
right___GGGTTCAATCC
_______= consensus sequence
TGGCNNAGTGG__GGTTCGANNCC: Nには任意の塩基が入る

1979 Witting & Witting: Chicken

tRNALys, histon, polymerase III → chromatin reconstruction
nucleosome – 8量体ヒストンは中心でのみtranscriptionされる

ミトコンドリア遺伝子 (mitochondrial gene)


Eukaryotes: Cu, Zn ⇔ mitochondria: Mn = Prokaryotes: Mn
ミトコンドリア有するDNA情報量 < 核DNAの1/10
1. Cytochrome oxidase
サブユニット = 同調的に合成される
    サブユニット   I      II    III    IV     V    VI   VII
    分子量       (40000) 22500 15000 11200  9800  7300   ?

II = ミトコンドリアDNAから
V = 核DNAから → 前駆体ポリペプチドは親水性で細胞質で合成される

N末端には疎水性(脂溶性)アミノ酸が多い
cytochrome oxidase subunitは膜中に埋め込まれていると考えられる
Diazobenzen sulfonate試薬(非特異的結合)による検出。膜両面から試薬を与え反応度合いを調べる。M-sideではIIIが、C-sideではII, V, VIが強く反応するが、I, IVはいずれでも反応しづらいことから予測された

2. Ribulose biphosphate carboxylase
L8S8 × 16サブユニット → L8 = ミトコンドリアDNA, S8 = 核DNA

実習 (experiment)


Fertilized egg利用assay system

Mouse metallo thionein I gene: 金属が細胞内にたまると活性化され金属を排除(解毒)する役割を持つ遺伝子のpromoter, regulator reigons – thymidine kinase gene
    Mouse PMK  +K enzyme              + K mRNA

               Liver  Kidney Brain    Liver  Kidney Brain

    19-2   +    1.37  1.44     ND       2.5    3.4    ND
    21-1   –
    21-2   –    1.89  2.26     ND
    21-3   –
    23-3   +    1     2.05    1.5
    23-2   +   66.8   4.44    1.23     28 <   22 <    2

: 発現した

(Wanger et al. 1981, Constantini & Cacy 1981,
Gordon & Ruddle 1981, Brinster et al. 1981)

Palmiter et al. (1982)

pMGHをmouseに注射 (human growth hormoneの本体部分をdetect) → mouse


    # pMGH/cell  mRNA/cell  Growth hormone   Growth
                            (μg/ml)         ratio

       20          800        57             1.87 ×
        1         < 50         0.87          1.02
        8             1.32
        2
        2
       10          1500       32             1.69
       35          3000      112             1.78
        0             0        0.16
        0             0

Copyする数が多いほど発現量が多い。Growth hormoneは一般に脳で合成される。しかし、この実験では働くpMTのpromoter + 上流部を持っているから生成されるに他ならない

Spradling & Rubin (1982), Rubin & Sprading (1982) experiment

ショウジョウバエ卵にgene注入
hybrid dysgenosis: P. strain ♂, M strain ♀
P elementが存在する(トランスポゾン) ~3 kbp
P elementが入ると、このmutantが異常をきたす
Ex. wild typeに戻る、extreme sn等
→ P elementの中間部分をとりryt geneを入れ込んだ

DNAマーカー DNA marker

できれば…少労力で多遺伝子座(locus)を一度に調査できるマーカー選択

+ 対象分離集団選択や遺伝実験系統の活用がマッピングの効率化の鍵

実験手法に基づく分類
1. サザンハイブリダイゼーション
RFLP (restriction-fragment-length polymorphism, 制限酵素断片長多型)
DNAフィンガープリント: DNA配列 = 指紋と同じように個体特有 Ex. 犯罪捜査で個人特定。遺伝病診断
Ex. ACGCT切断制限酵素

多系解析 → 元DNA同一なら断片長分布は同じ(= 同一個体DNAと推定)

手順
  1. DNA抽出(1滴の血痕、毛髪1本で十分) → PCR
  2. 制限酵素によりDNA切断
  3. DNA断片をアガロースゲル電気泳動
  4. 特殊ナイロンシート等をゲルに押し当ててゲルに含まれるDNA断片をシートに移し取る
  5. DNA検出用放射性物質(プローブ)を作用させX線フィルムに感光させる = フィンガープリント
Cf. 生化学でフィンガープリントという言葉を使ったのは、タンパク質研究

タンパク質特定部位を切断する制限酵素 → 断片はタンパク質ごとに独特の特徴
これを利用し、タンパク質全配列を分析せず、タンパク質の異同を判定する簡便法として開発される

minisatellite (VNTR, variable number of tandem repeat)
2. PCR (polymerase chain reaction, PCR)
Table. Characteristics of molecular marker (Rafalsky & Tingey 1993)
  • マーカー (原理) 検出変異 (ゲノム中量 多系度 1回調査可能遺伝子座数) 必要DNA量, 塩基配列情報
  • RFLP (ゲノムDNA制限酵素反応) 遺伝子置換, 欠失/挿入 (多中少) μg, 不要
  • Minisatellite (ゲノムDNA制限酵素反応) 反復数変化 (中高中) μg, 不要
  • Microsattelite (SSR挟むprimerによるPCR) 反復数変化 (中高少) ng, 要
  • RAPD (random primerによるPCR) 遺伝子置換, 欠失/挿入 (多中中) ng, 不要
  • RAMP (anchor primerとrandom primerによるPCR, 制限酵素反応) 反復数変化 (多高多) ng, 不要
  • SSCP (PCR, 制限酵素反応 / DNA変性) 遺伝子置換, 欠失/挿入 (多高中) ng, 要
  • CAPS (PCR, 制限酵素反応) 遺伝子置換, 欠失/挿入 (多中少) ng, 不要/要
  • AFLP (ゲノムDNAの制限酵素反応, アダプターのライゲーション 選択的primer用いたPCR) 遺伝子置換, 欠失/挿入 (多中多) ng, 不要

画期的DNA増幅法 (Kary et al. 1980 = 1993 ノーベル化学賞)

PCR (ポリメラーゼ連鎖反応, PCR)


1989 Science "The Molecule of the Year" (特許権$3億)

微量遺伝子をin vitroで純粋に十分量まで増やす → 様々な解析

原理: DNA = 相補的2本鎖 → 変性させ1本にしたDNA

+ dATP, dCTP, dGTP, dTTP + primer + DNA polymerase
⇅ [反復]

アニーリング: 相補的配列の1本鎖DNA同士が2本鎖形成 ⇒ 2nで増加

DNAを数時間で100万倍に増幅
PCR: 熱変性により1本鎖になったDNAにプライマーを結合させる反応

アンプリコン(増幅産物) amplicon: PCRで増幅されたDNAのこと

伸長反応: プライマーのアニーリング後、DNA polymeraseによりDNAの相補鎖を合成する反応
過去の難点: 94°C = DNA変性温度 ↔ DNA polymerase失活 ⇒ 1サイクル毎に酵素を足す必要

温泉中の高温耐性菌 → 耐熱性DNAポリメラーゼ(Taq DNA polymerase) = 94°Cでも失活しない
何度サイクルを繰り返しても減らない

⇒ 必要材料入れる(最初のみ): 94°C (DNA熱変性) → 55°C(アニーリング) → 72°C (DNA合成)

3段階温度変化を周期的に行う(サーマルサイクラーで完全自動化)だけ
Ex. ピコグラムDNA (pg) → 30回増幅 → μg (数時間弱で10億倍)
熱変性: (鋳型)2本鎖DNAに熱をかけ1本鎖DNAに解離させること

マイクロサテライト microsatellite [SSLP (simple sequence length polymorphism), SSR (simple sequence repeat)]

プライマー: 鋳型DNAに相補的な塩基配列を持つ合成オリゴヌクレオチド(短い1本鎖DNA, 10個程度)。増幅領域挟むよう2か所設計 = ペアをforward/reverseまたはsense/antisenseと呼ぶ

ゲノムDNA塩基配列上に個体間差存在 → 増幅DNA断片の種類・大きさに違い(= RAPD)

プライマーダイマー: プライマーを鋳型とし合成される目的外の増幅産物。プライマー同士で相補配列存在 → その部分がアニーリングし通常のPCRと同様に指数関数的に増幅 → 増幅サイズ短いため目的増幅産物よりも増幅効率高いことがある → 検出感度低下

インターナルコントロール, IC: PCR阻害の有無判別が目的

試薬にIC添加された系: IC増幅 = PCR阻害はないと判断 ⇔ ターゲット、ICともに増幅認められない = 偽陰性の疑い

鋳型(テンプレート) template
PCR: PCR増幅の元となるDNA
RT-PCR: 逆転写反応(RT, reverse transcription)に続いてPCRを行う方法

RNAはDNA polymeraseの鋳型とはならない → RNAをDNAに変換

転写: DNA → RNA ⇔ 逆転写: RNA → DNA

cDNA (complementary): 逆転写でRNAから変換されたDNA

= PCRの鋳型 ⇒ RT-PCR: RNAをPCRで増幅する手法

マスターミックス: まとめて調製した反応液

反応液調製時に、1反応分ずつ混合するのは操作性が悪く、正確性にも欠ける ↔ 鋳型以外の反応液(マスターミックス)をまとめて調製

リアルタイムPCR (real time PCR, quantitative PCR, qPCR)
PCR反応液の中に予め蛍光標識プローブか蛍光色素を添加し、リアルタイムで目的遺伝子の増幅をモニタリングする

利点: 電気泳動が不要なため迅速・簡便・定量的な解析可能

増幅曲線 amplification plot: PCR増幅過程を蛍光物質用いモニタリング

サイクル数(X軸)-蛍光強度(Y軸)関係をみる曲線

Ct値 (Cq値, threshold cycle): 増幅曲線-閾値交差するサイクル数

= PCR増幅産物がある一定量(閾値 threshold)に達した時のサイクル数
初期鋳型量多いとCt値小、少ないと大 → Ct値-初期鋳型量に相関関係
⇒ 検量線作成 - 未知サンプルの定量可能

クエンチング (消光, quenching): 蛍光を抑制すること

クエンチャー(消光物質): 蛍光物質の蛍光を抑制する物質

定量PCR: PCRにより定量的に検出すること(普通はqPCR装置用い行う)
サイクリングプローブ (qPCR蛍光検出法)
サイクリングプローブ: RNAとDNAからなるキメラオリゴヌクレオチド

一末端が蛍光物質で、他末端がクエンチャー物質で修飾

インタクト = 蛍光発しない → PCR増幅産物とハイブリッド形成 = 反応液中に含まれるRNase HによりRNA部分が切断され蛍光発する

サイクリングプローブのRNA付近にミスマッチ存在 → RNase Hによる切断なし → 配列特異性高い検出が可能 - SNPsタイピング等に最適

インターカレーター法 (qPCR蛍光検出法)
2本鎖DNAに結合し蛍光発するインターカレーターを反応液に加え、増幅に伴う蛍光を検出する方法。PCR産物増加に伴い蛍光強度は上昇
Tm値 (融解温度, melting temperature): 2本鎖DNAの半分が変性し1本鎖DNAとなる温度

プライマーのTm値はPCRのアニーリング温度を決定する参考

融解曲線分析 (melting curve, dissociation curve): インターカレーター法によるqPCRで、PCR増幅産物のTm値を確認する方法

PCR反応後、反応液温度を60°Cから95°Cまで徐々に上昇させ蛍光値をモニタリング → PCR産物が2本鎖を形成した状態では強い蛍光を検出 → ある一定温度(Tm値)に達すると1本鎖に解離し蛍光値が急激に低下 → Tm値はPCR産物の長さやGC含量により異なるので、目的増幅産物とプライマーダイマー等の増幅産物を区別できる

EMA-PCR: PCRにより生菌由来DNAを選択的に検出する方法
EMA (ethidium monoazide): DNA結合インターカレーターの一種

→ 可視光照射によりDNAに共有結合
細菌にEMA処理 → 生菌: 細胞膜に阻まれEMAは菌内部に浸透しない ↔ 細胞膜損傷した死菌: EMAが菌内部に浸透 ⇒ 細菌内に浸透したEMAはDNAに結合し光照射を行うとEMAがDNAに共有結合

エチジウムブロマイド: 2本鎖DNAに結合するインターカレーターの一種

電気泳動でDNA検出時に使用。発癌性(取扱注意)

UNG (uracil-N-glycosylase): PCR増幅産物のキャリーオーバーによる偽陽性を抑制する酵素

dTTPの代わりにdUTPを含む基質を用いPCRを行い、増幅産物にU塩基を取り込ませる。このPCR産物に対しUNG処理を行うと、U塩基の部分で加水分解され、キャリーオーバーを防止

マルチプレックスPCR
複数のターゲット領域を同一の反応液中で同時に増幅すること

増幅産物の電気泳動: 各ターゲットを増幅サイズにより区別し検出
qPCR: ターゲット毎にプローブの蛍光標識物質を変え区別し検出

コンタミネーション contamination
= PCRの鋳型となり得るDNAの混入

高感度検出法 → 微量DNA混入 → 増幅され判定結果に大きな影響

エアロゾル: DNA溶液のエアロゾル発生 → コンタミネーションの原因

高濃度DNA溶液の取扱には注意

エリア分け: 実験エリアを区分 = コンタミ対策
PCR反応液調製、検体からの鋳型DNA調製、PCR反応液への鋳型添加、電気泳動の場所を別にし、機器・器具等も部屋毎に用意 → 実験設備内で試料の流れを一方向にし反応液への増幅産物混入防ぐ
遺伝子検査
ある生物種固有塩基配列(遺伝子)を検出する検査 - PCR法良く使用
培養法に比べ、迅速に結果が得られ検出感度高い

核酸抽出 (extraction of nucleic acids)


熱抽出法: 熱処理によりDNA抽出する簡易的方法。主にグラム陰性菌(真菌やグラム陽性菌では、十分量のDNAが得られないこと多く適さない)
アルカリ熱抽出法: 簡易的なDNA抽出法。アルカリ条件下で熱処理を行い、中和後、遠心上清を回収

目的: 生体中からの核酸抽出原理を理解 [本来抽出核酸の性質を調べるが、既製核酸を用い核酸の定量及び定性(特にGC含量)測定を行う]
1. Schmidt, Thannhauser, Schneider法による核酸抽出
Step 1. 酸可溶化物の除去(よく冷やしながら行う)

0.5-5 g(w/w)のsampleを冷えた乳鉢mortar中でpestle乳棒を用いて、すり潰しながら10-20 mlの冷やした5% PCAを加え良くかき混ぜる
a) 10000 rpm for 5 min
b) pptを10-20 mlのcool PCAに懸濁

a-b → 3回繰り返す

c) pptを得る
良く冷やし手早く行う(暖まると酵素の影響や特にプリン塩基がはずれStep 3で分解されやすい)

Step 2. 脂質除去

a) Step 1のpptに95% Et-OHを10-20 ml加えて良く混ぜる
b) 5000 rpm for 10 min
c) pptに95% Et-OHを10-20 ml加えてよく混ぜる
d) 5000 rpm for 10 min
e) pptにEt-OH-Ether (3:1)を10-20 ml加えしばらくかき混ぜる

→ d-e: 3回繰り返す

f) (真空ポンプかドライヤーで) pptの溶媒をとばしsampleを乾燥させる

(ドライヤーではsampleが吹き飛ばないよう注意)

Step 3. RNA抽出

a) Step 2の乾燥pptを0.5 N KOH 37°C, 16-20 hrで処理

(加えるアルカリ量はfresh sampleあたり10 ml程度)

b) 冷やしながら6 N HClで中和(濃PCAによる中和も可能)

DNA proteinが肉眼で見える

c) 10000 rpm for 5 min
d) pptを5 mlの5% PCAでよく洗う → 2回繰り返す
e) 上清中にRNAがモノヌクレオチドとして存在する

Step 4. DNA抽出

Step 3のpptを5 mlの5% PCAに懸濁させ90°C 15 min放置(塩基遊離)
→ 冷やした後2500 rpm for 5 min
→ pptを5 mlのPCAに懸濁 → 2500 rpm for 5 min → 洗液・抽出液(上清中)にDNAが存在

材料: Pseudomonas aeruginosa (freezed intact cell): GC content 67 ± 1
長時間置くと塩基が取れるので注意。20°C, 37°Cの2種の温度で培養したものを別々に抽出し比較
結果: 抽出はできたが乾燥重量を計ることに失敗した
2. Ceriottiの方法によるDNA定量
方法(標準曲線作成)

DNA、0.04%インドール酢酸(難溶時は温水使用、冷所保存)、濃塩酸(SG 1.19)、クロロフォルム(高純度)

材料: 子牛胸腺DNA
手順
  1. 2.5-15 μgDNAを含む試料2 ml
  2. インドール試薬1 ml、濃塩酸1 mlを加え良く振る
  3. 沸騰水浴中で10 min加熱
  4. 冷却後4 mlのクロロフォルムを加えて良く振る
  5. 遠心し夾雑物による呈色物抽出する(水槽透明になるまで大凡3回位)
  6. 水槽の黄色呈色を490 nmで測定

抽出DNA sampleは2-3種類の濃度について同様の操作を行い定量。この方法では3.3%以下のPCA混入は影響が無い。又DNA濃度が低くPCA混入が大きくなる場合には濃縮する

3. DNA塩基組成分析
  1. PCAによる分解: 共栓試験管に60% PCAをDNAが6-8%になるよう加え栓をし100C, 1 hr加熱。冷却後、等量の水で薄め炭水化物を軽く遠心し除く
  2. PC: 核酸として200-500 μg (vol. 10-20 μl)をspot (Toyo 51A filter paper)し展開し乾燥させる
  3. 検出: 260 nm光に乾いたpaperをかざし黒いspotとして検出される塩基化合物部分をマーク。マーク部分を切り取り共栓試験管に入れ0.1-1 NのHClを加える(抽出37°C 1 day、室温の場合は数日放置)。濾紙片が入らぬように上清をとり吸光度A260を調べる
experiment
  1. 6 mg/0.1 ml
  2. spotは正確に置き、乾燥後、展開を15-20 cmまで行う
  3. 250-260 nmの単一波長が良い。今回NISO4·7H2O 3.5 g, CoSO4·7H2O 10 mlにしたものがca 260 mnを選択的に通したためそれを利用した
展開液及びRf値

_____________________________________A____G____C____T
methanol:concentrated HCl:water = 7:2:1__0.31__0.18__0.70__0.42
n-buthanol:0.6 N ammonia = 6:1_________0.64__0.23__0.89__0.42

検出には少なくともRf値が0.1以上の離れた展開液を用いる必要がある
検量線作成のための既知DNAの定量: 2回測定しその平均で作成

→ 7.5 (μg/ml), 15, 21, 24, 27 → 吸光度 = 0.088, 0.167, 0.213, 0.247, 0.250
抽出DNA定量: × 100は高濃度のため検量曲線上に乗らない - 除外

稀釈倍率___1st___2nd____Av___μg/2 ml sample
× 100____0.228__0.306__0.267__2540
× 200____0.157__0.161__0.159__3020
× 300____0.099__0.100__0.100__2925

得たDATAから2972.5 μg/2 ml sampleが得られる

4. イオン交換カラムクロマトグラフィーによるDNA塩基解析
材料: CoH thymus DNA
樹脂: Dowex 50W-X4, 200-400 mesh H+ for m
手順: DNA 2-3 mg (3 mg)を6N HCl 2 mlに溶かす → 100°C 3 hr加水分解 → 冷却後、水加え6 ml → DNA 1 mg相当をカラムに載せる → 2 N HCl溶出(流速: 30 ml/hr = 4 ml/tube) → 各塩基分画集め体積とA260計りモル数算出
準備: 2N HCl、Dowexを詰める(空流を行い流速計っておく)
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