微生物 microorganism

= 観察に顕微鏡が必要な生物の総称
= 真核生物 + プロトゾア、藍藻(原核生物) + バクテリア、ウイルス、イースト(プロチスタ Protista)

植物の病害抵抗性、環境ストレス耐性に関与
葉圏 phyllosphere: 微生物生息地となる植物地上部全体 (cf. endosphere)

細菌 procaryotae, mychota, monera, anucleobionta

生殖(増殖) reproduction

1. 体分裂 binary division : 栄養細胞の分裂
   Ex. E. coli: 好条件下で1分裂/20分
   ┣███┫ → ┣██████┫ → ┣███┫┣███┫
2. 分生子 conidiospore (conidium) Ex. Streptomyces放線菌
3. 小胞子 microspore: sporeに大小2種ある時に小さい方のsporeを指す
4. 内生胞子 endospore: 胞子嚢中に形成される胞子の総称

遺伝形質組換 changes of gene types

〇≡≡≡△
bridge = 接合

1. 接合 conjunction
2. 形質転換 transformation: Ex. 肺炎双球菌 Streptococcus pneumonia (Griffith - Avery)
3. 形質導入 transduction: 宿主細胞遺伝的形質がバクテリオファージ仲介で1細胞から他細胞へ移行する現象。原始的有性生殖とも言える
   

   
   膜: 細菌不透過 vs
         細菌ウイルス透過

利用 use of bacteria for human

1. 腐敗・発酵、寄生
2. 抗生物質antibiotic抽出
   Ex. オレオマイシン aureomycin = aureus (金色の, L) + mykes (かび, G): クロルテトラサイクリン商標名
   1948: 放線菌の1種から分離 → 黄色結晶(テトラサイクリン系抗生物質)

   クロロテトラサイクリン chlortetracycline 開発 - 肺炎・梅毒等広用途

3. 窒素固定(空中窒素固定菌)

糞便中から細菌・原虫発見 - 微生物発見(世界初)

後に細菌部類学の基礎築く

微生物培養(= 実験)可能となる (ゼラチンは後に寒天)
結核原因は結核菌を証明 (コッホの4条件 Koch's four postulates)

土壌中放線菌から抽出

本方法によりルーメン内セルロース分解菌分離

1. 夾膜と粘液層 capsules and slime layer

大きさは200-500 nm程度が普通。夾膜-粘液層の境は不明瞭な種もある
夾膜に対する抗原 = K-antigen (cf. O-antigen, H-antigen)

[ 繊毛 ]

2. 鞭毛 flagellum

→ [熱処理] or [高温処理] → 鞭毛再構成

→ reconstruction
B-type____A-type

基部で生産された情報により合成は先端で行なわれる

フックはCCW回転 = 細菌はフックの回転運動によって動く
問題: tumbling – bumblingが起こった時一瞬CW回転が生じる。刺激物 = 走化性物質様

Ex. Vibrio cholerae: 80 μm/sec or 288 μm/sec
回転運動起動力は、ATP加水分解エネルギーから得ると考えられていた(現在否定) →
1) Asを加えAd-pp-Asを作らせATP阻害を試みても運動能力は衰えない
2) Mg·Ca-ATPase欠損突然変異体でも鞭毛運動は衰えない
3) ATP阻害剤を細菌中に混入しても鞭毛運動への影響は見られない

protein motive force, electrochemical potential – 膜内外の電位差とプロトン勾配に基づく
ΔμH⁺ = FΔψ_in-out + 2.303RTΔPH_in-out

ATP合成時と同様、エネルギーによりプロトンが入って来る際に鞭毛が回る
Pr. Δψを例えばバリノマイシン(K⁺透過単体)を使って変えてやると運動性落ちる



疎水的な膜でもK⁺を含むと膜透過性がある
全ての内膜の[K+] = 数百mM
____– ポタシウムの濃度差を緩和
ΔpH: 外の[H⁺]を変えればΔpHは代わる

細胞内外のpH差(イオン濃度差)により細菌は運動する
バリノマイシン5 μgをBacillus subtilisに与えpHを7.5から6.5に下げる(膜電位変化)と細菌が動く

実験: Rhodospirillum rubrum (CCCP for ΔμH⁺ inhibitor)
同様にオリゴマイシンoligomycin (10 μg/l – ATPase inhibitor)とNaF (10 μg – PPase inhibitor)を与えると上図と同様の曲線がCCCPが入っている時に得られる – ATPは運動には関与しない(= 鞭毛基部回転はタンパク質の流れに従って行なわれる)

化学要因

(Glagolev & Skulachev 1978)
鞭毛タンパク質 = 10種類(1つはhook中の42,000、残り9つは60000-90000)

Laueger P (1977)

走化性 chemotaxis

ATPあるいはMetが欠如すると細菌はchemotaxisを起こさない。さらにS-adenocylmethionine (SAM)を加えるとchemotaxisが起こる
ATP + Met → SAM + PPi + Pi

MCP I欠如 (tsr mutants): セリン、グリシン、ロイシンに反応しない。温度変化の影響を受けない
MCP II欠如 (tar mutants): asparate, maltose, Co⁺⁺, Ni⁺⁺に反応しない
MCP III欠如(trg mutants): リボースおよびガラクトースに反応しない

3. 繊毛 pilus, pl. pili

Ex. Bordetella pertussis, Neisseria gomerrhoae

3分類群 Corynebacterium spp., Streptococcus spp.(連鎖菌), Mycobacterium smegmatisのみが知られる

分類 (classification)

感染 infection: 微生物が体内に侵入し足がかりを確立すること。人間に感染する場合、腸管壁に付着し増殖を始めることが第一条件となることが多い Ex. Salmonella

RNA phage(20面体)がpiliの回りに、棹状のDNA phageが先につく

F-like pili (sex factor, or F factor): 大。R factorや幾つかのcolicin factorを有さぬものはpili形成なし
I-like pili: ねじれている。Colicin Ib, 幾つかのR factorsが必要

4. 核 nucleus (in prokaryotes)

MW 28 × 10⁹ KDt, ca 3.2 × 10⁶ 塩基対 base pair (3.2 Mpb)

5. 細胞(内)顆粒 cytoplasmic granules

トリメタリン酸
最も一般的な形は直鎖型ポリリン酸等の形で含まれる

H₂Sが欠乏するとSできない
Sはさらに酸化されSO₄^2-になり硫黄顆粒sulfur granuleは消える

6. サイトプラスム cytoplasm

7. メソゾーム (mesosome)

タンパク質:_______________ 細胞膜 (50-57%) > メソゾーム
脂質・フォスフォリピッド・RNA:_細胞膜 ≈ メソゾーム

メソゾームの働きを呼吸中心と仮定するとmesosome/membrane ≫ 1.0にならないと辻褄が合わない
枯草菌のsuccinate活性は3.3という例外はある
→ 細胞壁生成機能を持つ? もし、細胞壁合成に関係しているならば細胞壁合成関連酵素があるはず

UDP-Mar, Nac-pentopeptide 欠如, translocase欠如, polyglycerophosphate synthetase欠如 以上より仮説否定

単一の働きから複合した働きがあるのではないかと言われていた

8. 細胞外皮 (cell) envelopes

細胞外皮 = これらの物質全体およびそれによって構成される構造

細胞の固い構造を保つため必要(細胞壁も構造保持機能持つ)

ペプチドグリカンpeptidoglycanが構成の中心

                       細胞壁
マイコプラスマ 欠く
グラム陽性菌  1層
グラム陰性菌  ≥ 2層   

構造

━━━━━━━━━━ 200 Å = CW
▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆ 70-80 Å = CM
▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆ cytoplasm
Peptidoglycan, tenichoic acid, polysaccarides: これらの組成により細胞壁構造異なる
細胞壁は細胞質内で作られた物質がCMを通り決められた場所に移動(原因不明)

▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆ リン脂質でできている = CW
▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆ (outer membrane, OM)
▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆ (inner membrane, IM) = CM
▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆

細胞外皮の構成因子 components of cell envelope

-G-M-G-M-G-M-
___|____|___|
___:____:___: → tetrapeptide

NH₂-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-COOH
||_______________________||
L-AlaのCOOH____________D-LysのNH₂ → Peptide bond
A type: 4番目のL-Ala-[cross linkage]-3番目のD-Lys
B type: 4番目のL-Ala-[cross linkage]-2番目のL-Glu
B type → L-Gluと結合するcross linkageの末端は必ずLys
Cross linkageの数は決まっていない

Ex. Erysipolothrix rhusiopathiae: NH₂-Gly-Lys-NH₂

Negative: E. coli = 8 nm
Positive: S. aureus = 15 nm, B. megatherium = 22 nm, Lactobacillus acidophilus = 80 nm
グラム陽性菌の場合タイコイン酸がこれに加わる

lipo teichoic acid + teichoic acid

Polytglycerol: (-OH残基1つ)
D-Ala, GluNacが交互についているものが観察されているらしい

Cf. Glycerol
CH₂-OH
|
CH-OH
|
CH₂-OH

P-CH₂
|
CH-OH
|
CH₂-P-

Piにより高分子化(約30単位)

Cf.
CH₂-OH
|
(CH-OH)₃
|
CH₂-OH

Polyribitol: (-OH残基3個)
P-C-C-C-C-C-P
____|__|
____↑_↑
どちらかにD-Ala
重要な点は反応基としての-OH残基が残っていること

Glycerolと同じで30単位位まで高分子化する

Ex. Salmonella LPS (outer core)
___________GlcNac_____Gal
__________- Glu____Gal_Glc__-Leptose-Leptose
---------------→ →------------------→ →------------------→ →---------→
O-side chain__O.C.__________Dihepotose region_(KDO)₃ region
____________Core
O-antigenを得る: 完全なO-side chainの細菌はsmooth strainとなる
→ O-side chainが突然変異等により簡略になるとrough strainとなる。これにより、o-antigenを緩和、即ちrough typeはantibodyと外膜の接触がsmooth typeと比べて多く反応を受け易い

細胞外皮基本構造 basic structure of cell envelopes

これらは成長のための分解酵素を含む

1. 構造を保つ
2. ファージphage, バクテリオシンbacteriosineの受容器receptor存在

tetra lysine (MW = 530) – through ↔ penta lysine (MW = 660) – stop → MW 600前後で通過できなくなる
EDTA処理後lysozyme (13930 dt)処理でMg-freeにし浸透圧変えると通過する
→ ものを通すためのタンパク質構造が膜上にある
OMはIMに比べてタンパク質が少ない。しかし、タンパク質の種類はIMに比べて少ないが量は多い

外側が疎水域になり、リン脂質の疎水域にはまり込める
サブユニット同士はアルカリのアミノ酸と酸性のアミノ酸との間で結合する
内径12.5 Å, 12量体だとすると35.8 Å

I: 90% cytoplasm
II: 85% cytoplasm, OM無, IMに結合しているものあり
III: 40% cytoplasm, OMに30%, IMに25%, periplasmに僅か
IV: 80% OM

Ex. 棹菌 rod-shaped bacteriaを10-20% sucrose溶液中に入れる → 原形質分離plasmolysis起こる
→ → adhesive zone

*: OM (phospholipids, liposaccharides, proteins – IM内で合成)
Sphenoplast (spontaneously): F-piliがつく

basal body of flagellum = motor on IM

ファージは粘着帯につく
仮説: この粘着帯を介して高分子の移動が行なわれているとすれば容易である(研究中)
phospholipidの場合IM ↔ OMの可逆的translocationが確認されている
lipopolysacharridesはIM ↔ OM

元素

一般に、微生物の方が大型生物よりもNとPに富む
C:N:P ⇒ レッドフィールド比に近い
_____________________________[一次生産]
106CO₂ + 16HNO₃ + H₃PO₄ + 122H₂O ⇄
_______________________________[呼吸]

(CH₂O)₁₀₆(NH₃)₁₆(H₃PO₄) + 138O₂

外洋では不足しがち (≈ 10^-12 M)

高栄葉塩・低クロロフィル (high nutrient-low chlorophyll, HNLC)

土壌中には多量に存在

真核細胞から見た微生物

太古地球環境に似る: 現細菌より古いという意味で命名(実は古くはない)

始原菌仮説 (Wosse et al.)

核遺伝子 ≈ 古細菌 → 細胞の元(説)

問題: 真核生物 = 核大、内部構造複雑
→ 複数細胞が融合し大きくなった細胞が真核細胞の起源? (融合で様々な遺伝子を持ち込む)

ミトコンドリア ≈ 酸素利用しエネルギー生産できる真正細菌(αプロテオバクテリア)
葉緑体 ≈ 光合成細菌であるシアノバクテリア
→ それぞれ別起源

スピロヘータの構造と真核細胞内の細胞骨格や中心体、精子尾等に構造上の共通性

分類法

a) 形態分類(系統)

Thiosp sp > 50 μm, Haemoph influenzae 0.2-0.5 μm

shape, chromatogenesis, opacity, elevation, surface, edge観察

単球菌: 細胞分裂後すぐに娘細胞は離脱 (以下は離脱せず集団形成)
双球菌
レンサ球菌
四連球菌
八連球菌
ブドウ球菌

短桿菌
長桿菌
レンサ状桿菌
螺旋菌
スピロヘータ

Ex. S. marcensens = red-orange, S. aureus = cream-yellow, M. agilis = pink

b) 化学分類 chemotaxonomy

絶対好気性 obligate aerobic > 微好気性 micro-aerobic

偏嫌気性 strict anaerobic > 通性嫌気性 facultative anaerobic

インビック試験 (IMViC test)

= インドール試験 + メチル赤試験 + ホーゲス・プロスカウエル試験 + クエン酸利用能試験

細菌がグルコースを酸化しacetyl carbonalを生産するか否かを観察

Citrateを炭素源として用いているか否か

c) 数量分類学 numerical taxonomy

(common characters)/(total characters, n > 50) × 100

全種をコードで表わす
Ex. 13680-1469:1 = Staphylococcus aureus
1: gram positive, 3: oxidase+, 6: …, 8: no spore, 0: immobile, 1: sp#

Kingdom Prokaryote 原核生物界

Domain Bacteria 細菌 (Eubacteria 真正細菌)

Phylum Aquificae

Phylum Thermotogae

Phylum Thermodesulfobacteria

Phylum Deinococcus-Thermus

Phylum Chrysiogenetes

Phylum Chloroflexi (緑色滑走細菌)

Class Chloroflexi

Order Chloroflexales

Order Herpetosiphonales

Phylum Thermomicrobia

Phylum Nitrospira

Phylum Deferribacteres

Phylum Cyanobacteria (藍藻細菌)

Phylum Chlorobi

Class Chlorobia

Order Chlorobiales

Phylum Proteobacteria (プロテオバクテリア), syn. Pseudomonadota

Class α-proteobacteria

Order Rhodospirillales

Order Rickettsiales (リケッチア)

雄殺し male-killing, 単為生殖 parthenogenesis, 雄の雌化 feminization

Order Rhodobacterales

Order Sphingomonadales

Order Caulobacteriales

Order Rhizobiales (リゾビウム)

Rhizibium = 生育速く酸産生
Bradyrhizobium = 遅くアルカリ産生

Nitrobacter winogradskyi 硝酸菌:
2HNO₂ + O₂ → 2HNO₃ + Energy (HNO₂ → NO₃)

Cp. Nitrosomonas

Class β-proteobacteria (ベータプロテオバクテリア)

Order Burkholderiales

Order Hydrogenophilales

Order Methylophiales

Order Neisseriales

Order Nitrosomonadales

2NH₃ + 3O₂ → 2HNO₂ + H₂O + Energy (NH₄OH → HNO₂)

2FeCO₃ + 3H₂O + 1/2·O₂ → 2Fe(OH)₃ + 2CO₂

Order Rhodocyclales

Class γ-proteobacteria

Order Chromatiales (≈ 紅色硫黄細菌)

Order Actithiobacillales

Order Xanthomonadales

Order Cardiobacteriales

Order Thiotrichales

Order Legionellales

Order Methylococcales

Order Oceanspirillales

Order Pseudomonadales シュードモナス

多種有機化合物分解能 (分解者) → 炭素循環/バイオレメディエーション

Order Alteromonadales

Order Vibrionales

Order Aeromonadales

Order Enterobacteriales (腸内細菌)

名前の通り腸内細菌 → モデル生物
短軸0.4-0.7 μm、長軸2.0-4.0 μm

Order Pasteurellales

Class δ-proteobacteria, nom. nud. (δ-プロテオバクテリア)

Order Myxobacteriales 粘液細菌

Order Bdellovibrionales

他のグラム陰性菌内部に侵入し細胞質を捕食し増殖

Class ζ-proteobacteria

Phylum Firmicutes (グラム陽性細菌門)

Class Bacilli バシラス

Order Bacillales バシラス

Order Lactobacillales (ラクトバシルス)

Class Clostridia クロストリジウム

Order Clostridiales クロストリジウム

Order Thermoanaerobacteriales

Order Halanaerobiales

Order Natranaerobiales

Order Thermoanaerobacteriales

Class Erysipelotrichi エリュシペロトリクス

Order Erysipelotrichales

Class Negativicutes ネガティウィクテス

Order Acidaminococcales アキダミノコックス

Order Selenomonadales セレノモナス

Order Veillonellales ベイロネラ

Class Thermolithobacteria Sokolova et al. 2007 テルモリトバクテル

Order Thermolithobacterales

Class Limnochordia Watanabe et al. 2015 リムノコルダ

Class Tissierellia ティッセレッラ

Phylum Tenericutes テネリクテス

Class Mollicutes モリクテス

Order Mycoplasmatales マイコプラズマ (Classとして分類)

Order Entomoplasmatales エントモプラズマ

Order Acholeplasmatales アコレプラズマ

Order Anaeroplasmatales アナエロプラズマ

Order Haloplasmatales ハロプラズマ

Phylum Actinobacteria (アクチノバクテリア. 旧, 放線菌)

Class Actinobacteria

Subclass Actinobacteridae

Order Actinomycetales (放線菌/放射菌)

栄養体多少とも分枝した菌糸体生じるが菌糸幅 < 1.5 μm
栄養菌糸 vegetative mycelium (基底菌糸 substrate mycelium)と立ち上がった気菌糸 aerial mycelium 持つ
増殖: 菌糸断裂、分生子や胞子嚢形成等
GC含量高 ≈ 70%

Suborder Actinomycineae

Suborder Corynebacterineae

Subclass Rubrobacteridae

Order Rubrobacteriales

Suborder Rubrobacterineae

Subclass Coriobacteridae

Order Coriobacteriales

Suborder Coriobacterineae

Subclass Sphaerobacteridae

Order Sphaerobacterales

Suborder Sphaerobacterineae

Suborder Frankineae

nifD-K: フランキア特異的

Suborder Micrococcineae

Suborder Micromonosporineae

Suborder Propionibacterineae

Suborder Pseudonocardineae

Suborder Streptomycinae

Suborder Streptosporangineae

Order Bifidobacteriales (ビフィドバクテリウム)

B. longum BB536 (特定保健用食品, 森永)

Phylum Planctomycetes

Class Chlamydiae

Order Chlamydiales

Phylum Spirochaetes

Class Spirochaetes

Order Spirochaetales 螺旋菌(スピロヘータ)

Phylum Fibrocacteres

Phylum Acidobacteria (アシドバクテリウム)

環境中16S-rRNAから推定される多様性は大
推定: 真正細菌中で大型の門

Phylum Bacteroidetes (バクテロイデス)

Class Bacteroides

Order Bacteroidales

Class Flavobacteria

Order Flavobacteriales

Class Sphingobacteria

Order Sphingobacteriales

Phylum Fusobacteria (フソバクテリウム)

Class Fusobacteria

Order Fusobacteriales

Phylum Verrucomicrobia

Phylum Dictyoglomi

B. subtilisは内生胞子1つであり、クローンにより増やしたコロニーを調べると遺伝的制御が確認される。コロニーは螺旋を描きながら増えるので、その機構が調べられている

増殖速度測定法

顕微鏡下で一定区画内の菌数を数える。実際には死菌をも数えるため過大評価となる

貧栄養湖等では菌数が極少 → 濾過濃縮してから検鏡

      長さ 面積 比抵抗
孔     L     A        ρ₀
細菌  l      a        ρ    

膜間に電圧をかけておき、そこを細菌が通過すると微少だが抵抗が増す。その電位差ΔV(通過した細菌数に比例)の度合いから粒子数(菌数)測定
体積推定もできる(誤差大)
ΔE/E = ΔR/R (E: 電圧, R: 抵抗)

孔に平行に細菌は通過したと過程(これと実際の通過経路とのずれが大きいほど誤差は大)
R = ρ₀L/A·ρl/a
ΔR = vρ/A²(ρ/(ρ – ρ₀) – a/A)^-1 (v: 細菌の体積)
∴ ΔE/E = ΔR/R = v/V(ρ/(ρ – ρ₀) – a/A)^-1 (V: 体積)

→ aはAより十分小さいと仮定

= v/V·(ρ – ρ₀)/ρ ≈ v/V

[一般成長式]

成長曲線 growth curve

Lag phaseの存在

増殖速度 growth rate

Δn/(logn₂ – logn₁)/(t₂ – t₁) = log2/T

このようにして平均世代時間Tは求められる
実際はt = t₂ – t₁となる増殖過程(のある区間)をとることが多い。

比増殖速度 specific growth rate

細菌数 n: k = 1/n·dn/dt
物質数 μ: μ = 1/x·dx/dt

→ lag phaseでの測定よりT, Lは求まる

n代目はlog₂n₀ + nで表わせる(最初は0代)

最大生産量 maximum population or yield

Y: 収量 yield (収量定数, yield coefficient or constant)

= 生成ATP数 [反論: 定量的関係はない]

共代謝 co-metabolism (共酸化)

生成物質: 他微生物が利用可能な状態へ変化 ⇒ 物質循環系形成
バイオメディエーション等への応用研究中 Ex. 農薬分解系

バッチ系: 容器中に培養液を入れ微生物を閉鎖的に増殖
連続系: 容器内に絶えず同量の培養液を流入・流出させ培養

連続培養 continuous culture

μ = (1/x)·(dx/dt) 基質依存 → cf. Michaelis constant: v = V·S/(K_M + S)
μ = μ_m·s/(K_S + s) … (1)
sを変える → μ = 0 - μ_m

K_S: saturation constant
s: substrate concentration
μ_m: maximum μ at saturation (= μ_max)

集積培養 enrichment culture: 自然環境かその採取試料の培養

発酵型微生物 zymogenic group: 外部栄養物により増殖
↔ 固有型微生物 autochthonous group - 集積培養困難

選択培養 selective culture: 培地栄養条件調整し特定微生物を増殖

Ex. 無機塩培養 - 化学合成無機栄養微生物発見

増殖と基質濃度

D: 希釈率 dilution rate, f: 流速 (ml/t), V: 培養液の濃度(m/V)

洗い出しの速度 –dx/dt = D_x (槽内の菌数) … (3)

状態_定常状態_______菌数増加__菌数減少(洗い出し)
μ____= D_x → dx/dt = 0___> D________< D

同調培養 synchronous culture

(理想)同調培養

Seitz filter (Cu製, Ptメッキ)

Upper layer: Toyo filter #1, 2 layered, Lower layer: Toyo filter #126, 18 layers, etc.

E. coli, lag phase 1 l → final 2 ml (10'' cells)濃縮, 50 mlの培地を2.5 ml/secで洗い出す

Small-sized bacteria__________Large-sized bacteria

10-40% 500 g, 10 min → large cells, 4% of total bacteria
2-12% 2500 g, 20 min → small cells (top fraction), 2% of total
_____________________bacteria

菌が引っかかる____rinse: 分裂後の若い細胞を集める

同調細菌より酵素(ATC, asparate transcarbamylase)抽出 → 高活性 → 酵素生成も同調

1: 富栄養-貧栄養で増殖可
2: 貧栄養でのみ増殖可 (好貧栄養性微生物/低濃度栄養性微生物)

同調培地での増殖(成長)

化学栄養細菌類: 無機塩類、CO₂、(光)
人工培地で育たない細菌も存在し、栄養要求性は多様である。乳酸菌、梅毒菌は栄養要求性が細かい
Ex. E. coli: 無機塩類 + ブドウ糖 = 最少培地 minimum medium

1) 培地組成 medium composition

Ex. molt extract, meat extract, peptones, potato extract, milk, yeast extract

___________________X factor_______V factor
H. influenzae___________+____________+
H. parainfluenzae___- (ヘミン, Fe)__+ (NAD, NADP)

2) 無機塩類 mineral salts

3) 炭素源 carbon source

利用できない細菌も結構いる Ex. Vibrio ABE-1, Flavobacterium
利用できないのはpermease hexolcinaseが無いからと言われるが未詳

4) 窒素源 nitrate source

5) 発育系 growth factor (≈ bacterial vitamin)

自然条件での増殖

→ 自然培養(微生物生態学)と純粋培養(微生物生理学)との乖離

スライドグラスを土壌や水中に埋没 → 顕微鏡観察
1932 Hendrichi: 本方法により淡水中の微生物観察 - 極めて多様

毛細管を埋没させ毛細管中に微生物を収める

微生物叢/細菌叢 microbiota

⇒ 微小生態系 microcosm: 微生物含めた微小生態系 Ex. 水溜、金魚鉢

水と湿度

結合水: 基質構成成分であるタンパク質や炭水化物と固く結合した水
自由水: 環境や温度、湿度の変化で容易に移動や蒸発がおこる水 = 微生物繁殖利用可能な水

自由水の割合 = 水分活性 water activity (a_w) = 蒸気圧 vapor pressureを測ればよい(Scott 1953)

概ね基質平衡相対湿度(ERH)の1/100 → a_w = P/P₀ = ERH/100
一般にa_w = 0.63-0.99
細菌(含藍藻・動物プランクトン)は上限に近い値でないと生活できない
→ a_w < 0.5: 殆どの微生物増殖抑制

好乾性 xerophilic: 陸上植物、サボテン、トノサマバッタ
好湿性 hydrophilic: 細菌、菌類(cf. xerophilic fungi, a_w < 0.63)

• 水分活性: 微生物 = 食品/水分(%)
• 0.950: E. coli, Pseudomonas, Proteus, Shigella, Klebsiella, Bacillus, Clostridium, Perfringens, some yeasts = 生鮮果実・野菜/87. ソーセージ/69-66. パン/35. かまぼこ/73-70
• 0.910: サルモネラ菌, ボツリヌス菌, コレラ菌, 腸炎ビブリオ, Serratia, Parahaemolyticus, Phicia, Lactobacillus, Pediococus, Rhodotorula = チーズ/40. ハム/65-56。果汁/88-66
• 0.870: 酵母 (Candida, Torulopsis, Hansenula), Micrococus = シラス干し/59. サラミソーセージ/30. スポンジケーキ/25. 塩鮭/60
• 0.800: カビ(mycotoxigenic Penicilla), 黄色ブドウ球菌, most Saccharomyces (baillii) spp., Debaryomyces = 米/14-13. 豆類/−. イカ塩辛/64. フルーツケーキ/−
• 0.750: 好塩菌, mycotoxigenic Aspergilli = ジャム･マーマレード/30. 蜂蜜/16. 醤油/−
• 0.650: 耐乾性カビ (Aspergills chevalie, A. candidus, Wallemia sebi), Saccharomyces bisporus = 裂きイカ/30. ゼリー/18. 干しエビ/23
• 0.600: 耐浸透圧性酵母 (Saccharomyces rouxii), カビ数種 (Aspergills ecbinulatus, Monascus bisporus) = 乾燥果実/17-15. 煮干/16. 小麦粉/14-13
• < 0.500: 増殖不可 = 麺類/12. 全卵粉末/5. クッキー・クラッカー/5-3. 乾燥野菜/5<

浸透圧

Ex. グラム陽性菌 = 20 atm, グラム陰性菌 = 5-10 atm.

↔ 狭塩性 stenohaline: 耐性範囲が狭い

Cf. 菌類菌糸 – burstしない: 内部浸透圧を下げburst避ける, プロトゾア– 積極的排水, 花粉発芽

水圧 water pressure

Ps. bathycetes, 1000気圧, 3°C → Lag phase = 4 months, generation time = 33 days, stationary phase = 1 yr?
E. coliに圧670 atm → translocation部が圧に敏感でinitiation step働かない。転写は余り影響受けない
Ex. β-galactosidase(誘導酵素)

細菌は加圧後に酸素生産していない → translation部位の影響

Ex. 多価アミラーゼ: 6000 atm/cm²にすると変性する

pH (pH)

Thiobacillus → H₂SO₄, Acetobacter → CH₃COOH
代謝産物がH₂SO₄やCH₃COOH等の細菌は必然的にacidophilicになる

Bacillus alkalophillus (ca pH 11), B. alkaliphillus → 多量のNH₃必要

E. coli, amino acid dehydrogenase → 塩基性, Deaminase → 酸性

→ 細菌が環境を都合のよいように変えうる

温度 temperature

→ 液体培地(水溶液)中で10分おくと死ぬ時の温度
実際は測定困難 → 変わりにthermal death temperatureを用いること多
Ex. 無胞子性細菌: 湿熱 hydration = 47°C – 数時間, 60°C – １時間, 70°C – 5分, 80°C – 2-3分 (例外は多い)
乾熱では非常な高温に耐えることが多い。Ex. 160°C – 1時間

凍結防止剤 anti-freezerを加え凍らせず測定
Ex. 30°Cで増殖させると極めて効率が悪い= 測定困難

成長に最適な温度 – 成長率曲線より求める

最適温度: 理論上左右対称
タンパク質や脂質変性により温度上部で成長止まる

変性なければ最大温度はもっと上

菌根ヘルパー細菌 mychorrhiza helper bacteria, MHB

促進 -菌根菌(ベニテングタケ) ↔
阻害 - 植物病原菌(Armillaria obscura, Heterobasidion annosum)

クロマツ菌根圏: Bacillus, Ralstonia

微生物群集 microbial community

   微生物密度↓  耐乾性胞子形成細菌↓  放線菌↓  糸状菌↑

細菌: 塵や埃に付着し大気中で生存か?
胞子: 単独で浮遊 - 空気中に胞子を飛散させる多数の種

好圧性微生物 barophile: 数百気圧以上の圧力でのみ増殖可 - 深海
湖沼: 多様性 → 富栄養湖 > 貧栄養湖

冬期 = 対流 → 鉛直方向種組成変化小 ↔ 夏期 = 滞留 → 大

1972 ZoBell: 海水中の藍藻 = 300種 →

30種 浮遊生物 + 残り 付着生物 periphyton

  深部: 化学合成無機栄養微生物
1968 山岸: 土壌中細菌の80%以上が土壌粒子に吸着

好気性細菌(O₂消費) → 嫌気性細菌 (遷移)
腐植分解細菌 → 他種依存

植物根棲息種: 生きた植物内でのみ棲息可能

群集解析

a) コロニー培養: 培養困難な細菌では不可
b) 染色細菌数カウント: 細菌数のみの情報

細菌等からゲノムDNA調製し16S rRNA該当領域の塩基配列解析 - データベース利用し分類群推定可能

biodiversity ∝ function (or redundancy)
仮定: 高い多様性は高いresilience (or redundancy)を持つ

環境 (environments)

1)温度

好熱菌 (好熱性細菌 tempmophilic bacteria)

40-100°C: 好熱性細菌(普通は70deg;C程度で成長) → 超好熱菌: 100°Cで働く酵素を持つ

Pyrolobus fumarii: 121°Cのオートクレーブ処理でも死なない

8-50°C: 中温(常温)菌 ≠ 始原菌
< 20°C: 好冷菌 ≠ 始原菌

熱安定 thermolysin: 表面に2、内部に2のCa⁺⁺の存在。Ca⁺⁺を除くと熱失活する
Glu synthetase = 70C, 5 hrでも100%活性がある (Ca⁺⁺, Mg, Mn, Substances = L-Glu, NH₄Cl)
α-amylase – Ca⁺⁺
Thermus aquatics: 常温で不活性 = 37°Cでは生存できない

aldolase = optimum temperature 95°C (97°C 20' 100% active)
endolase = o.t. 85C (85°C, 120', 100% active)
+ RNA, DNAにも熱耐性 – G/C content

一部の細菌では脂肪酸が熱に安定な糖脂質に置き換わっている

2) pH

3) 塩分

⇔ 超好塩性生物: > 15% NaCl

低好塩性 ___ 2-5% NaCl (海水3.3-3.7%)
中好塩性 ___ 5-20
高好塩性 ___ 20-30 (NaCl 4 M = 23% at 20°C)

P = CRT = 4 × 0.082 × 293 = 96.104
→ NaCl解離度合考慮(等張係数 = 1.71)
∴ 96.104 × 1.71 ≈ 164 atm
この範囲でないと生存できない(普通なら原形質分離値)。好塩性細菌はNa⁺, K⁺の盛んな取り込みを行なう

Pseudomonas B16 (low halophilic bacteria): [Inner] Na⁺, Cl⁺ ≈ Outer solution, [Innter] K⁺ > Outer solution → K⁺が10-30倍に濃縮
[Innter] K⁺ > Outer solution → K⁺が10-30倍に濃縮
高好塩細菌ではK⁺が細胞内に100倍以上に濃縮される

     NaCl (M)                外液 細胞内 比率(%)
低 Pseudomonas B16  0.3   0.123   41
中 Vibrio costicola       1.0    0.684   68.4
     Ps. 101                   1.0   0.90     90
     Paraeocus              1.0   0.311    31.1
高 Ps. sp.                     4.4   0.62     14.1
     Salcina morrhuae   4.0   3.17     70      

Ex. 1. Succinate DH

Ex. 2. Cytochrome oxidase (両実験とも精製酵素ではない)

好塩性細菌タンパク質は一般に酸性のものが多い
仮説

低張度ではgNaで外へ捨てる。細菌では、外周近くが高濃度で中央に行くにつれ低濃度になる
同じ細菌でも表皮近くと内部でNaに対する酵素性質異なる → 細菌でも酵素性質がその分布により異なる

K⁺と結合したもの活性あり → 非結合のが非活性

______→ -K⁺ →
inactive ↔↔↔↔ active
______← +K⁺ ←

非好塩性細菌タンパク質でも、コハク酸等を使いアミノ基をカルボキシル基と置換させると好塩性時に活性化タンパク質となることもある

酸性 = 塩必要な1要因
E. coli (通常菌)

→ 19 proteins + rRNA

→ 35 proteins + rRNA

Halobacterium (好塩菌)

→ 19 acidic proteins + rRNA

→ 35 acidic proteins + rRNA: K⁺が必要となる

始原菌: 5S RNA → 酸性タンパク質多
進化的なもので好塩菌に限らずHBRP存在し一概に塩を好むからHBRPがあるとはいえない

バクテリオロドプシンにより光エネルギーを用いてプロトンを汲み出す → プロトン勾配形成
= 電気化学ポテンシャル → ATP合成、Na⁺排出

4) 圧力

_好圧生物: 中程度の圧力条件下(10-80 MPa)で増殖
_超好圧生物: 高圧条件下 (> 80 MPa)で増殖

メタン菌(-生成菌/-産生菌/-生成古細菌) methanogen

実験培養困難: 特殊ガラス容器に培養液入れ、加圧し水素ガス注入閉栓

→ 孵卵器内培養

人工増殖困難 → ドブ環境 = 好適環境(自然生態系壊すと復元困難)

化学反応(メタン生成)でエネルギー獲得 (※ 系統分類群ではない)
利用栄養分: 水素、蟻酸、酢酸、CH₃OH等の低分子物質
メタン発酵: 水素、蟻酸、酢酸やメタノールを酸化し出る電子を用いCO₂を還元しメタン生成

水素や蟻酸 → メタン: Methanobacterium
酢酸やメタノール → メタン: Methanosarcina
水素、酢酸や酪酸 → メタン: Methanococcus

Ex. 球菌 + 桿菌。運動性細菌 + 非運動性細菌
Ex. グラム陽性菌 + グラム陰性菌 + 好熱菌

メタノフラン (MFR), テトラヒドロメタノプテリンZ (H4MPT), 補酵素M (HS-CoM), 補酵素B (HS-CoB), 補酵素F420 (F420, Max_abs = 420 nm + 蛍光 → 顕微鏡下で他細菌との区別に有効), 補酵素F430 (F430)

多くの生理生化学的研究は高温性メタン生成細菌で行われる

= 増殖遅 → 取扱い難しく生態的研究遅れる

他環境からの発生メタンガスは大気放出 = 温暖化

メタン菌による生活排水浄化

*浄化 = 微生物処理: 微生物と空気の接触をよくし好気性微生物の勢い強める → 分解速度早まる

飲料可能水と僅かな残渣のみに変換可

メタン生成細菌 vs 水素生成細菌

Phylum Myxomycota (Myxobionta) 変形菌(粘菌)植物門

栄養生活相 = アメーバ相: 細胞壁なくアメーバ状

= 偽変形体pseudoplasmodium (アメーバ状に集合したもの) か変形体plasmodium形成

生活環の一時期にアメーバ相持つ + 別時期に肉眼で見えるキノコ様胞子嚢形成し胞子散布する

食作用phagocytosis (エンドサイトーシスendocytosisの一種)による

系統 phylogeny

              アラクシア型                    ディクチオ型
              細胞性粘菌    真性粘菌          細胞性粘菌
                ↑              ↑             ↑
    寄生粘菌類  │          エキノステリウム  アシトステリウム
      ↑        │              ↑             ↑
      │        │              │ ┌----------┘
      │        │          原生粘菌類        ラビリンチュラ類
      │        │              ↑             ↑
    ----------------------------------------------------------
    (植物的) ←          鞭毛プロチスタ         → (動物的)

Class Acrasiomycetes アクラシス

Order Acrasiales アクラシス

リマックス型: アメーバ細胞は1葉状仮足出し運動速度速く、細胞の前後の区別が明瞭
飢餓状態 → 集合し柄も胞子も細胞性の子実体形成

Dictyostelium: D. discoideum キイロタマホコリ(モデル生物)
Polysphondylium

Class Labyrinthulomycetes ラビリンチュラ

Order Labyrinthulomycetes ラビリンチュラ(網状粘菌)

Class Myxomycetes 変形菌 (真正粘菌/真性粘菌)

Subclass Ceratiomycetidae ツノホコリ (原生粘菌)

Order Ceratiomixales ツノホコリ

成熟胞子: 4個の単核相含み、胞子は発芽し4核持つ1個の原形質塊を生じ、有糸分裂後に8個の遊走細胞を生じる。減数分裂は胞子中で行なう

Ceratiomyxella tahitiensis: 多核アメーバ - 1核を残し他の核は崩壊 → 3回核分裂し8核となる → 細胞質分裂で8個の鞭毛細胞形成
Planoprotostelium fungivorum: 多数の鞭毛有する

Subclass Myxogastromycetidae 真正変形菌 (真正粘菌)

胞子嚢 sporangium
蟠曲子嚢体 plasmodiocarp
塊状子嚢体(エタリウム) aethalium

Order Liceales

Order Echinosteliales

Order Trichiales

Order Physarales

Order Stemonitales

Phylum Plasmodiophoromycota ネコブカビ

Class Plasmodiophoromycetes ネコブカビ

Order Plasmodiophorales ネコブカビ

グラム染色 Gram stain(ing)

細菌分類基準

ペプチドグリカン層厚 → 染まりやすい

ペプチドグリカン層薄 + 外膜有する → 染まりにくい
事後、陰性であればサフラニン染色等を行うことがある

実習 (strain observation)

材料

1. Bacillus subtilis 枯草菌: 最適成長温度 optimum growth temperature (OGT) = 37-40°C (B. natto, B. mensatricus: 2種に分類, 現在同種)
2. Escherichia coli: OGT = 37°C
   
3. Serratia marcensens 霊菌: OGT = 24-30°C
4. Staphylococcus aureus 黄色ブドウ球菌: OGT = 37°C
5. Micrococcus agilis 単球菌の1種: OGT = 25°C (0.5 M NaCl – halophilic bacteria, colony = pink, slow growth)
6. Sporosarcina sp. 八連球菌の1種: OGT = 24°C
7. Vibrio sp. ABE-1: OGT = 15°C, 25°C以上で成長できない

染色 staining (含, グラム染色)

1. Fuchsin liquid: ca 11 g fuchsin + 100 ml absolute ethanol
2. Methylene blue liquid: ca 5 g methylene blue + 100 ml absolute ethanol
3. Gentian violet liquid: 7 g gentian violet + 100 ml absolute ethanol
4. Gramのヨード液: 1 g indigo + 2KI + 100 ml water
5. 95% ethanol
6. 5% chroric acid
7. 1-3% H₂SO₄
8. 5% phenol

染色液

1. Loeffer’s methylene blue: 30 ml (2) + 100 ml (8) → filtration
2. Carbal fuchsin: 10 ml (1) + 100 ml (3)
3. Dilute carbal fuchsin: (b)を5-10倍に希釈
4. Carbal gentien: 10 ml (3) + 100 ml (9)

単純染色 simple staining

胞子染色 spore staining

総じて時間を計っておくと、後々便利

(西沢・菅原)

鞭毛染色

• 第1液: Distilled water (100 ml) + タンニン酸 (5 g) + 50%塩化第II鉄 (1.5 ml) + ホルマリン (2.0 ml)
• 第2液: Distilled water (100 ml) + 硝酸銀 (2.0 ml) + 28% 高方アンモニア水 (少量)

手順: 1: 若いslantに滅菌水2-3 ml入れ1-2 hr放置.   2: 菌泳ぎ出し滅菌水薄く白濁したものをピペットで少量とりslide glassに乗せる.   3: 風乾(火焔滅菌と固定しない).   4: 媒染・固定: 第1液を乗せ2-3 min放置.   5: 静かに水洗.   6: 染色: 第2液を載せる(数秒).   7: 水洗.   8: 風乾.   9: 検鏡

水中菌観察

1. 蛇口滅菌: 水を勢い良く出し蛇口洗浄(or アルコールランプで熱し水を1-2分出してから排水)
2. プレート作成
   1. Pour plate: 原液、10倍希釈液を0.5, 1.0 mlとり無菌シャーレ(流したら良く混ぜる)に入れ溶かした高層寒天に流し込む
   2. Spread plate: 原液、希釈液0.1, 0.2 mlを手板プレートにたらし、スプレッダーで均一に広げる
3. 培養24°C
4. コロニー数カウント(一定時間間隔で)

有機溶媒として一般にエーテル・エタノールの混合物を使用し、酵素変成を避けるために室温で抽出
有機溶媒に対する溶解度が室温で最適になるように溶媒を選定

細菌からの脂質抽出分析

濃度 concentration

乾固直前にロータリーエバポレーターを止め脂質を目盛付試験管に移す。ナス型フラスコにクロロフォルムを適量(毎回同量)加え壁面を3回繰返し洗う

共栓は試験管にN₂-gasと一所に封入。保存の際には-20°C

結果

           Bacteria W.W  Blank      B.W.W.-Blank  Lipid
    20°C  0.01403 g     0.00057 g  0.01346 g     0.00213 g
    37°C  0.01657       0.00057    0.01600       0.00420