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(2021年5月6日更新) [ 日本語 | English ]

微生物学 (microbiology)






有珠山 / サロベツ泥炭採掘跡
1986年, 2006年の有珠山火口原. ワタスゲ・エゾカンゾウ

微生物 microorganism

微小で肉眼で観察できない(ような)生物に対する便宜的総称 (< 100 μm)

= 観察に顕微鏡が必要な生物の総称
= 真核生物 + プロトゾア、藍藻(原核生物) + バクテリア、ウイルス、イースト(プロチスタ Protista)

マイクローブ microbe
= 微生物 (s.s. 病原菌に限定 ≈ 細菌・病原菌 germ)
エンドファイト (内生菌, endophyte): 植物体内に共生する微生物

植物の病害抵抗性、環境ストレス耐性に関与
葉圏 phyllosphere: 微生物生息地となる植物の地上部全体 (cf. endosphere)

細菌 procaryotae, mychota, monera, anucleobionta

原核細胞 prokariotic cellだが細胞内膜系としてメソゾーム mesosome、色素胞(クロマトフォア)chromatophoreの見られるものもある
従属栄養的 heterotrophic → 腐生/寄生 (独立栄養 autotrophicなものもある)
光合成 photosynthesis か化学合成 chemosynthesis を行う
生殖(増殖) reproduction
  1. 体分裂 binary division : 栄養細胞の分裂
    Ex. E. coli: 好条件下で1分裂/20分
    ┣███┫ → ┣██████┫ → ┣███┫┣███┫
  2. 分生子 conidiospore (conidium) Ex. Streptomyces放線菌
  3. 小胞子 microspore: sporeに大小2種ある時に小さい方のsporeを指す
  4. 内生胞子 endospore: 胞子嚢中に形成される胞子の総称
遺伝形質組換 changes of gene types
有性生殖はないが遺伝形質の組み換えがみられる

≡≡≡
bridge = 接合

  1. 接合 conjunction
  2. 形質転換 transformation: Ex. 肺炎双球菌 Streptococcus pneumonia (Griffith - Avery)
  3. 形質導入 transduction: 宿主細胞遺伝的形質がバクテリオファージ仲介で1細胞から他細胞へ移行する現象。原始的有性生殖とも言える

    reproduction
    膜: 細菌不透過 vs
          細菌ウイルス透過

利用 use of bacteria for human
  1. 腐敗・発酵、寄生
  2. 抗生物質antibiotic抽出
    Ex. オレオマイシン aureomycin = aureus (金色の, L) + mykes (かび, G): クロルテトラサイクリン商標名
    1948: 放線菌の1種から分離 → 黄色結晶(テトラサイクリン系抗生物質)

    クロロテトラサイクリン chlortetracycline 開発 - 肺炎・梅毒等広用途

  3. 窒素固定(空中窒素固定菌)
. 自然科学史生物学中の微生物学史年表
1675 Leeuwenhoek, Antonie van (1632-1723): 手製顕微鏡(倍率150倍)

糞便中から細菌・原虫発見 - 微生物発見(世界初)

1749 Ncedham: 肉汁に微生物自然発生
1776 Spallmzani: 密封加熱実験で自然発生否定
1796 Jemer: 種痘の人体実験
1821 Fries: カビ分頼体系化
1826 Schwann et al.: アルコール発酵は酵母による
1807 Schwann: 発酵・腐敗の微生物要因説
1850 Mitscherlich: ジャガイモ褐変要因は細菌
1850 Davaine: 炭疽病家畜血液内に炭疽菌観察
1853 De Bary: 穀類のカビは寄生カビによる
1858 Pasteur: 乳酸発酵要因は細菌
1864 Lister: 消毒外科手術の開発
1870 Lewis: アメーバ赤痢病原体発見
索引
1872 Cohn: 細菌の分類記載
1875 Brefeld: カビ純粋培養
1875 Bruce: ナガナ病患著からトリパノゾーマ発見
1876 Tyndall: 空気中に細菌確認
1876 Koch R (1843-1910): 炭疽病病原菌分離, 再発症実験

後に細菌部類学の基礎築く

1879 Neisser: 淋菌発見
1880 Laveran: マラリア接合子を人血中に発見
1881 Pasteur, Roux: 炭疽菌による免疫実験
1882 Eberth-Gaffky: チフス患者よりチフス菌分離
1882 Schloesing Muentz: 土壌の硝化は細菌による
1882 Koch: ゼラチン平板培養法開発

微生物培養(= 実験)可能となる (ゼラチンは後に寒天になる)
結核原因は結核菌を証明 (コッホの4条件 Koch's four postulates)

1885 Escherich Teodor: 乳酸菌発見 (腸内細菌研究の始まり)
1888 パスツール研究所設立
1884 Gram HC (1853-1938): 細菌の差別染色法(グラム染色)
1892 伝染病研究所設立
1885 Hellriegel, Willfarth: 根粒のN2固定は細菌による
1888 Beijerinck: 根粒菌純粋分離. 集積培養考案
1889 北里柴三郎: 破傷風から嫌気性病原菌分離
1897 Buchner: 無細胞系アルコール発酵
1890 VonBehring, 北里: ジフテリア抗毒素発見
1890 Winogradsky: 独立栄養硝化細菌分離
1892 Iwanowski: タバコモザイク症からウイルス分離, 再感染実験
1895 Beijerinck: 独立栄養硫酸還元菌分離
1897 Frosch Loeffler: 動物から濾過性ウイルス発見
1898 Nocard Roux: 牛肺疾からPPLOを分離培養
1914 北里研究所設立(第1次世界大戦)
1898 Ross: ハマダラ蚊によるマラリアの媒介発見
1909 Orla-Jensen: 細菌分類に生化学性状を導入
1910 Ehrlich, 秦: 梅毒治療薬サルバルサン発見
1926 Kluyver et al.: 発酵に量子伝達概念導入
1917 D'Herelle: バクテリオファージ発見
1927 Griffith: 肺炎菌の形質転換発見
1929 Fleming, Chain A (1881-1955, 英): 青カビからペニシリン分離
1931 Van Niel: 紅色細菌の嫌気的光合成発見
1935 Domagk G Trefouel (1895-1964, 独): スルファニルアミド発見
1936 Stanley: タバコモザイクウイルス結晶化
1940 Fleming: ペニシリン治療実験成功
1940 Beadle, Tatum: アカバソカピの突然変異
1943 Delbrueck-Luria: 細菌の突然変異
1944 Waksman, Selman Abraham (1988-1973): ストレプトマイシン発見

土壌中放線菌から抽出

1945 Reyniers JA (米): 無菌動物飼育装置開発 - 微生物実験発展
1947 Tatum, Lederberg: 大腸菌(E. coli)に性を発見
1950 Hungate, Robert E (米): 嫌気性細菌培養法(ロールチューブ法)開発

本方法によりルーメン内セルロース分解菌分離

1958 Meselson, Stahl: E. coli DNAの半保存的複製機作証明
1977 Woese, Carl: 古細菌発見
1995 Venter Craig: 細菌全ゲノム配列決定

形態 (morphology)


1. 夾膜と粘液層 capsules and slime layer

原核生物細胞壁外側にある高分子有機物だが必須形態ではない。突然変異等で欠失することもあり機能未詳

大きさは200-500 nm程度が普通。夾膜-粘液層の境は不明瞭な種もある
夾膜に対する抗原 = K-antigen (cf. O-antigen, H-antigen)

[ 繊毛 ]

2. 鞭毛 flagellum

多くの微生物が鞭毛を有し、分類上重要形態 = 運動性 mobile
配置: 極性
幾本かの蛋白質繊維が縄状にからまった構造。Eukaryotes’s compound flagellumの様な9+2構造を持ったものではない flagellum
構造: 3構成部 = 基部 + フック + フィラメント
鞭毛の集まり assembly of filament - flagellin subunit: どのように細胞壁に表れるかは不明
実験1. 細菌鞭毛

→ [熱処理] or [高温処理] → 鞭毛再構成

実験2. A型鞭毛細菌(直毛) + B型鞭毛細菌(曲毛) → 鞭毛再構成 = A型
実験3. A型鞭毛細菌の抗体を加える

Flagellum→ reconstruction
B-type____A-type

実験4. 直毛と曲毛の鞭毛の再構成

Flagellum
基部で生産された情報により合成は先端で行なわれる

実験5. E. coli鞭毛切断 → 膜外にフックのみ表れる = 長フックの突然変異

フックはCCW回転 = 細菌はフックの回転運動によって動く
問題: tumbling – bumblingが起こった時一瞬CW回転が生じる。刺激物 = 走化性物質様

収縮弛緩運動 = 回転運動の基礎 → 鞭毛運動は数10 μm/sec

Ex. Vibrio cholerae: 80 μm/sec or 288 μm/sec
回転運動起動力は、ATP加水分解エネルギーから得ると考えられていた(現在否定) →
1) Asを加えAd-pp-Asを作らせATP阻害を試みても運動能力は衰えない
2) Mg·Ca-ATPase欠損突然変異体でも鞭毛運動は衰えない
3) ATP阻害剤を細菌中に混入しても鞭毛運動への影響は見られない

仮説: エネルギー源としてATPではなく、ATP合成の"中間産物"を利用する

protein motive force, electrochemical potential – 膜内外の電位差とプロトン勾配に基づく
ΔμH+ = FΔψin-out + 2.303RTΔPHin-out

Flagellum ATP合成時と同様、エネルギーによりプロトンが入って来る際に鞭毛が回る
Pr. Δψを例えばバリノマイシン(K+透過単体)を使って変えてやると運動性落ちる



Flagellum 疎水的な膜でもK+を含むと膜透過性がある
全ての内膜の[K+] = 数百mM
____– ポタシウムの濃度差を緩和
ΔpH: 外の[H+]を変えればΔpHは代わる

細胞内外のpH差(イオン濃度差)により細菌は運動する
バリノマイシン5 μgをBacillus subtilisに与えpHを7.5から6.5に下げる(膜電位変化)と細菌が動く
Flagellum
実験: Rhodospirillum rubrum (CCCP for ΔμH+ inhibitor) Flagellum
同様にオリゴマイシンoligomycin (10 μg/l – ATPase inhibitor)とNaF (10 μg – PPase inhibitor)を与えると上図と同様の曲線がCCCPが入っている時に得られる – ATPは運動には関与しない(= 鞭毛基部回転はタンパク質の流れに従って行なわれる)

化学要因
グラム陰性菌: 下部リング(S, M)のみ = 上部対はロッド支持には不要 → SとMは必須器官ではない

flagellum
(Glagolev & Skulachev 1978)
鞭毛タンパク質 = 10種類(1つはhook中の42,000、残り9つは60000-90000)
flagellum
Laueger P (1977)

走化性 chemotaxis
正常移動は反時計回り counter-clock-wise (CCW)であるがtumblingが起こると時計回りclock-wiseになる
誘引物質 attractantsg – CCW
忌避物質 repellents – 同軸回転tumbling増える

ATPあるいはMetが欠如すると細菌はchemotaxisを起こさない。さらにS-adenocylmethionine (SAM)を加えるとchemotaxisが起こる
ATP + Met → SAM + PPi + Pi

タンパク質(膜に結合, 60 Kd)はglutamate groupに属し、メチル化と非メチル化が繰り返される(未単離)
Fig. Methylated (-dimethylated)

flagellum

[実験] E. coli mutants (methylated chemotaxis proteins, MCPs I, II, III)
各々の突然変異体は異なるMCP反応性を示す

MCP I欠如 (tsr mutants): セリン、グリシン、ロイシンに反応しない。温度変化の影響を受けない
MCP II欠如 (tar mutants): asparate, maltose, Co++, Ni++に反応しない
MCP III欠如(trg mutants): リボースおよびガラクトースに反応しない

E. coli等の細菌はいくつかの物質と結合しており、これらの突然変異株strainを用いた研究進行中

3. 繊毛 pilus, pl. pili

Anderson et al. (1949): 電子顕微鏡で発見。長さ30-250Å, 13-18 kD
グラム陰性菌による研究が多かった

Ex. Bordetella pertussis, Neisseria gomerrhoae

グラム陽性菌: 一般に細胞壁厚く染色不適

3分類群 Corynebacterium spp., Streptococcus spp.(連鎖菌), Mycobacterium smegmatisのみが知られる

分類 (classification)
a) 細菌性線毛 bacterial fimbria or common pili
幅4-10 nm, 長さ0.5-数μm, 100-300 pili/cell, MW = 13-18 kD
Hydrohobic L-amino acids (Ex. PAK = 43.9%, F = 53%, Type I = 43.6%)
赤血球、白血球、イーストで繊毛はよく知られる

感染 infection: 微生物が体内に侵入し足がかりを確立すること。人間に感染する場合、腸管壁に付着し増殖を始めることが第一条件となることが多い Ex. Salmonella

b) 性繊毛 sex pili (or fimbriae): 最初はE. coliで発見
雄株 male strain:

RNA phage(20面体)がpiliの回りに、棹状のDNA phageが先につく

雌株 female strain pili
2種類確認 (共にplasmid性) → common piliと異なり数少なく1-2本/細胞程度

F-like pili (sex factor, or F factor): 大。R factorや幾つかのcolicin factorを有さぬものはpili形成なし
I-like pili: ねじれている。Colicin Ib, 幾つかのR factorsが必要

DNA transportは性繊毛(F pili)を通じてconjunctionより頻度は落ちるが行なわれている

4. nucleus (in prokaryotes)

染色体chromosome = バクテリア遺伝子。分子量 28 × 109 KDt, ca 3.2 × 106 塩基対 base pair (3.2 Mpb)
理論上3000種のタンパク質合成 = 3000遺伝子 (1970 Taylor : 310遺伝子マッピング → 317遺伝子)
プラスミドとエピゾームplasmid and episome
プラスミド: 細菌細胞内で自律的に複製できる遺伝因子で細菌細胞増殖自体の増殖にはなくてもよいもの
エピゾーム: 主染色体外遺伝子 extra-chromosome で寄主に潜り込めるもの (Jacob & Wollman 1961)

Ex. sex factors, colicin, λ-phage
ミトコンドリアDNAやプラスチドDNAはプラスミドだがエピゾームではない

a) 自己複製単位: 自身の複製replication、segregationを指令 = 染色体と同調して行なわれる

F factor: 1-2 oligo-copy plasmids, stringent type plasmids, mulcopy plasmids (Coli E1), helix

b) プラスミド遺伝子plasmid gene: 細胞自身の生殖(増殖)のためには基本的ではない。薬剤抵抗(R factor)
c) プラスミド消失 – プラスミドは時々消える: 人為的例: acridin (Hirota 1960), SDS (Tomoeda 1968), Ni, etc.
d) プラスミドDNA: 二重螺旋の閉じたループ closed loop
構造: 共有結合部分がある – スーパーコイル super-coil or helix 構造

Ex. 一ヶ所切断すると、プラスミドがocDNA (open circular DNA)となるためcccDNA (covalently closed circular DNA)であることが解析できる

_________DNase
CccDNA →→→→ ocDNA
_______→→→→
_______DNA ligase

1.2-1.5 MDt (106 dt)が最初のプラスミド。例外的にpBR345 (0.7 MDt)という極小プラスミドが知られているが、これはdimerをなし結果的には1.4 MDtである。最小プラスミドは1.2-1.5 MDt位といえる

機能: F factor (fertility factor) - 50タンパク質

F+ strain: 独立した形で保有しているもの
Hfr strain: 主染色体に入り込むタイプ
F' strain: プラスミド中の遺伝子を主染色体と一部すりかえるか、残していくか、または取り去っていくもの
F' lack × F+ → F+, F' lack → やはり2タイプの株が形成される

R factor: 医学的には薬剤耐性因子として大問題

主染色体の耐性能力としてはリボゾームタンパク質構造の変形による程度の能力しか有していない。ところが、R factorは抗生物質に変化を起こさせる(Ex. アセチル化による抗生物質不活性化)ことで耐性獲得。しかもR factorのR+からR-への伝播は早い
F factorとR factorは、結構阻害等の干渉はあるが共存できる – F pili

コリシンファクター colicin factor: 腸内細菌で良く見られ、近縁種に対し抗生物質産出

このプラスミドは他細胞上に伝播可能なものと不可能なものがある
伝播は他プラスミドに乗り他細胞へ移動 (一般にF factor利用)


    伝播可能                             伝播不可能

    Col B, Col E  F pili形成に関与       Col E, Col E2, Col K
    Col I         I-like pili形成に関与

分解プラスミド degradation plasmids
ミルク中: Streptococcus lactis, S. cremoris
free amino acids – few
カゼインcasein (protease), ラクトースlactose (lactase)等の形で存在 – 遺伝子はプラスミド上
E. coli, Salmonella: ショ糖発酵 – 遺伝子はプラスミド上
Pseudomonas: 多種多様な物質を餌にする

naphthalene – NAH plasmids, salicylate – SAL plasmids, Camphor – CAM plasmids, n-octane – OCT plasmids, toluene, xylene – TOL plasmids のように資源化能を有するプラスミド

5. 細胞(内)顆粒 cytoplasmic granules

a) リボゾームr ibosome
b) 異染(ボルチン)顆粒volutin granule
ポリリン酸
トルイジンブルーで染めると紫色にメタクロマチンmetachromatinが染まる
cf. 細胞内顆粒中、リン酸が多量につながったもの: リポ核酸タンパク質、脂質、Mg++
Klebsieila, Azotobacter, Escherichia, Micrococcus, Nitrosomonas等が含む。細菌以外にChlorella, Euglenaでも存在

ribosomeトリメタリン酸 ribosome
最も一般的な形は直鎖型ポリリン酸等の形で含まれる

高エネルギーリン酸結合(9 kcal)が確認される
volutin granuleはエネルギー貯蔵(ATP補充)の役割はなく、単なるリン酸のプールと考えるべき
c) クロマトフォア(色素胞) chromatophore
細胞膜起源。光合成細菌特有。膜系持つ。60 nm
d) Poly-β-hydroxylutyrate granule (PHB)
Sudan blackで良く染色される。大きさ700 nm程度
細菌だけに存在しているわけではなく、藍藻・原生動物の一部でも確認される
PHBは貯蔵物質であろうと考えられている
β-hydroxybutrateが600-2500分子つながる。膜で包まれているらしい
Acetyl Co-Aがβ-hydroxybutyrateの起源
e) タンパク質結晶
B. thuringiensis胞子が斑点を作ることから確認。巨大結晶(機能不明)。タンパク質抽出 → リシンに対し特性
f) 液胞(ガス気胞) vacuole: Holobacterium (好塩菌)、他数種類で確認
g) 硫黄 sulfur
光合成細菌 H2S + CO2 → [CH2O] + S(蓄積)
化学合成細菌: 硫化化合物を酸化する

H2Sが欠乏するとSできない
Sはさらに酸化されSO42-になり硫黄顆粒sulfur granuleは消える

6. サイトプラスム cytoplasm

7. メソゾーム (mesosome)

化学組成: 細胞膜との相違 – 量的差あるが質的差は殆んどない。リン脂質組成も質的差ない

タンパク質:_______________ 細胞膜 (50-57%) > メソゾーム
脂質・フォスフォリピッド・RNA:_細胞膜 ≈ メソゾーム

酵素活性: succinate dehydrogenase (DH), malate DH, NADP DH, NADH oxidase, etc.

メソゾームの働きを呼吸中心と仮定するとmesosome/membrane ≫ 1.0にならないと辻褄が合わない
枯草菌のsuccinate活性は3.3という例外はある
→ 細胞壁生成機能を持つ? もし、細胞壁合成に関係しているならば細胞壁合成関連酵素があるはず

UDP-Mar, Nac-pentopeptide 欠如, translocase欠如, polyglycerophosphate synthetase欠如 以上より仮説否定

単一の働きから複合した働きがあるのではないかと言われていた

⇒ 1970年代後半: アーティファクトであると結論 (experiment)

8. 細胞外皮 (cell) envelopes

= 細胞壁 + ペリプラズム(細胞周辺腔含む) + ペプチドグリカン + 細胞膜OCM

細胞外皮 = これらの物質全体およびそれによって構成される構造

細胞の固い構造を保つため必要(細胞壁も構造保持機能持つ)

ペプチドグリカンpeptidoglycanが構成の中心

[グラム染色]

構造

-----------------------------
                       細胞壁
マイコプラスマ 欠く
グラム陽性菌  1層
グラム陰性菌  ≥ 2層
-----------------------------

a) グラム陽性菌の典型的構造

━━━━━━━━━━ 200 Å = CW
▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆ 70-80 Å = CM
▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆ cytoplasm
Peptidoglycan, tenichoic acid, polysaccarides: これらの組成により細胞壁構造異なる
細胞壁は細胞質内で作られた物質がCMを通り決められた場所に移動(原因不明)

b) グラム陰性菌

▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆ リン脂質でできている = CW
▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆ (outer membrane, OM)
▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆ (inner membrane, IM) = CM
▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆▆

細胞外皮の構成因子 components of cell envelope
a) ペプチドグリカン peptidoglycan
網目状構造: GluNac (N. acetylgucosamine), MurNac (N. acetylmuramic acid)
i) 骨格部: G-M-G-Mのβ-1, 4 bond
ii) 側鎖部: D-Ala, L-Glu, L-Ala

-G-M-G-M-G-M-
___|____|___|
___:____:___: → tetrapeptide

iii) 交鎖結合(クロスリンケージ) cross linkage

NH2-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-COOH
||_______________________||
L-AlaのCOOH____________D-LysのNH2 → Peptide bond
A type: 4番目のL-Ala-[cross linkage]-3番目のD-Lys
B type: 4番目のL-Ala-[cross linkage]-2番目のL-Glu
B type → L-Gluと結合するcross linkageの末端は必ずLys
Cross linkageの数は決まっていない

Ex. Erysipolothrix rhusiopathiae: NH2-Gly-Lys-NH2

ペプチドグリカンの厚さがグラム陽性菌と陰性菌で異なる

Negative: E. coli = 8 nm
Positive: S. aureus = 15 nm, B. megatherium = 22 nm, Lactobacillus acidophilus = 80 nm
グラム陽性菌の場合タイコイン酸がこれに加わる

b) タイコイン酸(テコイン酸)teichoic acid (L. teichos = wall)
グラム陽性菌 + Butyrovibrio fibriosolvans (Gram陰性菌)

lipo teichoic acid + teichoic acid

グラム陽性菌全てがこの構造をとるわけではないが、陰性菌では1例を除きteichoic acidは未確認

Polytglycerol: (-OH残基1つ)
D-Ala, GluNacが交互についているものが観察されているらしい

Cf. Glycerol
CH2-OH
|
CH-OH
|
CH2-OH

P-CH2
|
CH-OH
|
CH2-P-

Piにより高分子化(約30単位)

Cf.
CH2-OH
|
(CH-OH)3
|
CH2-OH

Polyribitol: (-OH残基3個)
P-C-C-C-C-C-P
____|__|
_____
どちらかにD-Ala
重要な点は反応基としての-OH残基が残っていること

Glycerolと同じで30単位位まで高分子化する

c) リポ多糖質 lipopolysaccharides:
Outer-side (O-side) chain構造が細菌の特性を決定している

Ex. Salmonella LPS (outer core)
___________GlcNac_____Gal
__________- Glu____Gal_Glc__-Leptose-Leptose
---------------→ →------------------→ →------------------→ →---------→
O-side chain__O.C.__________Dihepotose region_(KDO)3 region
____________Core
O-antigenを得る: 完全なO-side chainの細菌はsmooth strainとなる
→ O-side chainが突然変異等により簡略になるとrough strainとなる。これにより、o-antigenを緩和、即ちrough typeはantibodyと外膜の接触がsmooth typeと比べて多く反応を受け易い

d) リン脂質 phospholipids
脂肪酸 CH3(CH2)nCOOH: C16, C18多く、更に不飽和脂肪酸持つもの多い
炭素鎖長 → 沸点高 (不飽和脂肪酸増加 → 沸点低) → 好熱菌・好冷菌膜構造はこれにより調節される
細胞外皮基本構造 basic structure of cell envelopes
A) 膜モデル membrane model
i) Danielli model - 反証実験で殆ど否定
タンパク質粒子モデルも実測値と予測値の間に1:600の開きがあり殆ど否定
ii) シンガー・ニコルソンモデル Singer-Nicholson model
B) サイトプラズミックメンブレン cytoplasmic membrane
グラム陰性菌では内膜に等しい。膜系がないので細胞膜上で代謝がなされ、細胞膜は最も重要な系である
C) 外膜 outer membrane
グラム陰性菌のみ。酵素は昔はphospholipaseのみと言われていた
→ □ → □□ → □ + □
OMが肥大成長し、分裂面が出来るためには酵素が必要
Ex. E. coli: 3'-nucleotidase, 5'-nucleotidase, Mur-Nac-L-Ala amidase, N-acetylmuramidase等がOMに存在

これらは成長のための分解酵素を含む

IM: 呼吸合成酵素群 → OMは生存上の重要性としてはIMほどではない 機能:

1. 構造を保つ
2. ファージphage, バクテリオシンbacteriosineの受容器receptor存在

分子盾 molecular shield

tetra lysine (MW = 530) – through ↔ penta lysine (MW = 660) – stop → MW 600前後で通過できなくなる
EDTA処理後lysozyme (13930 dt)処理でMg-freeにし浸透圧変えると通過する
→ ものを通すためのタンパク質構造が膜上にある
OMはIMに比べてタンパク質が少ない。しかし、タンパク質の種類はIMに比べて少ないが量は多い

α-ヘリックス構造 α-helix structure

helix 外側が疎水域になり、リン脂質の疎水域にはまり込める
サブユニット同士はアルカリのアミノ酸と酸性のアミノ酸との間で結合する
内径12.5 Å, 12量体だとすると35.8 Å

IMの内側表面は負にチャージする部分多 → Free polysomeから塩基性アミノ酸ができると、それにより膜に結合しbonded polysomeになる → 疎水性アミノ酸ができると、それが膜中へ入リ一定の場所が切れprocessingが起きる
なぜ一定の場所に蓄積できるのか → そのための情報をpeptideが持つ?

I: 90% cytoplasm
II: 85% cytoplasm, OM無, IMに結合しているものあり
III: 40% cytoplasm, OMに30%, IMに25%, periplasmに僅か
IV: 80% OM

何かしら重要な意味を持ったpeptideがあるらしい
D) ペリプラスム periplasmic space, or periplasm
細胞壁と細胞膜の間の空間。この空間から特異的酵素見つかる → 抽出
高張液hypertonicにつける(osmic shock)するとleak out。次に低張液(水、希釈緩衝液等)につける
酵素: alkaline phosphatase (OM), cyclic phsophodiesterase (cAMPの5'-endを切断), 5'-nucleotidase
タンパク質: 結合タンパク質(結合するアミノ酸決まっている) Ex. Leu, Ile, Val
E) 粘着帯 adhesion zone
1963 Cota Robels, 1968 Bayer

Ex. 棹菌 rod-shaped bacteriaを10-20% sucrose溶液中に入れる → 原形質分離plasmolysis起こる
phagephage → adhesive zone

1) 性繊毛 F-pili との関係

pili *: OM (phospholipids, liposaccharides, proteins – IM内で合成)
Sphenoplast (spontaneously): F-piliがつく

2) (Adhesive zoneにある)鞭毛との関係

basal body of flagellum = motor on IM

3) ファージとの関係

ファージは粘着帯につく
仮説: この粘着帯を介して高分子の移動が行なわれているとすれば容易である(研究中)
phospholipidの場合IM ↔ OMの可逆的translocationが確認されている
lipopolysacharridesはIM ↔ OM

元素

主要構成元素 = C, N, P, S (珪藻 + Si)

一般に、微生物の方が大型生物よりもNとPに富む
C:N:P ⇒ レッドフィールド比に近い
_____________________________[一次生産]
106CO2 + 16HNO3 + H3PO4 + 122H2O ⇄
_______________________________[呼吸]

(CH2O)106(NH3)16(H3PO4) + 138O2

微量元素
Fe: 微生物が必要な量は僅か(C:Fe ≈ 104)であるが制限要因となる

外洋では不足しがち (≈ 10-12 M)

高栄葉塩・低クロロフィル (high nutrient-low chlorophyll, HNLC)

土壌中には多量に存在

表. 細菌類の夾膜物質
グラム陽性菌
物質の種類物質名(構成成分)菌名夾膜の種類
多糖質
 糖
 アミノ酸
 ウロン酸
 アミノウロン酸


ベプチド、タンパク質
dextran(グルコース)
lavan(果糖)
(アミノ酸)
(糖、アミノ酸)
(グルコース、マンノース、ウロン酸)
(グルコース, N-acetylmannos-aminuronic acid)
Hyaluronic acid (グルコサミン、グルクロン酸)
r-D-グルタミルペプチド
r-DL-グルタミルペプチド
Mタンパク質
Leuconostoc mesenteroides
Streptococcus salivarius
Bacillus megaterium
Streptococcus pneumoiae
B. circulans
Micrococcus luteus
Streptococcus spp. (A, C群)
B. anthracis
B. subtilis (natto)
Streptococcus spp. (A群)
細胞外粘質
細胞外粘質
夾膜
夾膜
夾膜
夾膜
夾膜
夾膜
夾膜
夾膜
グラム陰性菌
多糖質





リポタンパク質、リポタンパク多糖質
セルロース(グルコース)
デキストリン(グルコース)
(ウロン酸)
Vi抗原(アミノウロン酸)
(fucose, ガラクトース, hexuronic acid)
Polyribophosphate
Acetobacter aceti
Cluconobacter oxydans
Klebsiella
Salmonella typhi
Escherichia coli
Haemophilus influenzae
細胞外粘質または繊維
夾膜
夾膜、ルーズな夾膜
ミクロ夾膜
夾膜
夾膜
ミクロ夾膜

[ 原核生物命名規約 ]

分類 (taxonomoy)


s.s. 原核生物 = 始原菌(古細菌) archaea (archaebacteria) + 真性細菌eubacteria (一般に言う細菌 bacteria)
s.l. 原核生物(s.s.) + ウイロイド viroids + ウイルス viruses

真核細胞から見た微生物

真核細胞: 3箇所にDNA = 核 + ミトコンドリア + 葉緑体(植物)
古細菌 archaebacteria: 高温・高塩・高イオウ等に棲む

太古地球環境に似る: 現細菌より古いという意味で命名(実は古くはない)

→ 始原菌 archaea と改名 = 第3の生物
始原菌仮説 (Wosse et al.)
真核生物 = 古細菌細胞内に真正細菌共生

核遺伝子 ≈ 古細菌 → 細胞の元(説)

問題: 真核生物 = 核大、内部構造複雑
→ 複数細胞が融合し大きくなった細胞が真核細胞の起源? (融合で様々な遺伝子を持ち込む)

ミトコンドリア ≈ 酸素を利用しエネルギー生産できる真正細菌(αプロテオバクテリア)
葉緑体 ≈ 光合成細菌であるシアノバクテリア
→ それぞれ別起源

マルギュリス説: スピロヘータが運動性のあるタンパク質を持ち込む

スピロヘータの構造と真核細胞内の細胞骨格や中心体、精子尾等に構造上の共通性

分類法

a) 形態分類(系統)
グラム染色 Gram staining: 細胞外皮構造
大きさ: 一般に長さ2-4 μm, 幅0.5-10 μm

Thiosp sp > 50 μm, Haemoph influenzae 0.2-0.5 μm

鞭毛/細菌鞭毛 (bacterial) flagellum
胞子染色 spore staining
寒天培養 agar culture

→ shape, chromatogenesis, opacity, elevation, surface, edgeを観察

外部形態 form of bacteria (中間体はありうる)
菌形態(顕微鏡レベル): 大きくは球菌と桿菌に分ける
球菌 coccus Ex.

単球菌: 細胞分裂後すぐに娘細胞は離脱 (以下は離脱せず集団形成)
双球菌
レンサ球菌
四連球菌
八連球菌
ブドウ球菌

桿菌 bacillus: 円筒状 Ex.

短桿菌
長桿菌
レンサ状桿菌
螺旋菌
スピロヘータ

bacterial ectoplasm: bacteriochlorophyll and carotenoid, etc.を有しphotosynthesisを行うbacteriaもおり、これらの成分はectoplasm中にある。この系列は独立栄養autotrophicである
コロニー形態 (肉眼レベル)
形 form: circular, irregular, rhizoidと大きさsize
色素形成 chromogenesis

Ex. S. marcensens = red-orange, S. aureus = cream-yellow, M. agilis = pink

透明度 opacity
高さと盛り上がり方 elevation: flat, raised, convex
表面: smooth, rough, glistering, etc.
縁: entire, undulate, lobate, rhizoid, dentate
臭い odor
b) 化学分類 chemotaxonomy
嫌気性 anaerobic: obligate anaerobic

通性嫌気性 facultative anaerobic

↔ 好気性 aerobic: obligate aerobic > 微好気性 micro-aerobic
酸素 → 酵素反応

Ex. satlase, nitrate reductase, β-glucosidase, carbonhydrate

成長率
ピグメントpigments
加水分解ゼラチン hydrolysis gelatin
DNA, G/C content
インビック試験 (IMViC test)
代謝産物の検定により化学反応の存在を確かめ分類同定指標とする

= インドール試験 + メチル赤試験 + ホーゲス・プロスカウエル試験 + クエン酸利用能試験

1. インドール反応 indole reaction
2. メチルレッド反応 methyl red reaction
3. ホーゲス・プロスカウエル試験 Voges-Proekauer test

細菌がグルコースを酸化しacetyl carbonalを生産するか否かを観察

4. クエン酸利用能試験 citrate test

Citrateを炭素源として用いているか否か

c) 数量分類学 numerical taxonomy
1957 Smith: 親和度Affinity (%) =

(common characters)/(total characters, n > 50) × 100

1961-71 Cowan: 異端的記号分類法 heretical taxonomy

全種をコードで表わす
Ex. 13680-1469:1 = Staphylococcus aureus
1: gram positive, 3: oxidase+, 6: …, 8: no spore, 0: immobile, 1: sp#

[新タクソン, Bergey's Manual revised in 2001, ed. Garrity]

分類群 (taxon)


Kingdom Prokaryote 原核生物界

Domain Bacteria 細菌 (Eubacteria 真正細菌)

細胞球形 coccus - 棹状 bacillus
細胞壁丈夫。有鞭毛では通常周鞭毛
グラム陰性-陽性(科でほぼ一定)
横分裂増殖(内生胞子形成するものあり)

Phylum Aquificae

グラム陰性好熱性細菌
温泉・海底火山 - 水素を酸化

Phylum Thermotogae

グラム陰性好熱性細菌
熱水噴出孔・油田 - 有機物を発酵

Phylum Thermodesulfobacteria

好熱菌、硫黄還元細菌

Phylum Deinococcus-Thermus

放射線耐性菌、好熱性細菌

Phylum Chrysiogenetes

グラム陰性

Phylum Chloroflexi (緑色滑走細菌)

Class Chloroflexi

Order Chloroflexales
Chloroflexaceae (緑色糸状細菌): Heliothrix - 光合成行う
Order Herpetosiphonales

Phylum Thermomicrobia

Phylum Nitrospira

Phylum Deferribacteres

Phylum Cyanobacteria (藍藻細菌)

Phylum Chlorobi

Class Chlorobia

Order Chlorobiales
栄養体普通0.5-1.0 μmの微小単細胞
細胞小器官未分化であり組織形成しない
Chlorobiaceae (≈ 緑色硫黄細菌)
光合成細菌 = 酸素非発生型光合成
絶対嫌気性

Phylum Proteobacteria (プロテオバクテリア)

細菌最大の多様性
リポ多糖(LPS)から成る外膜 - グラム陰性
好気性細菌(一部嫌気性)
水系菌種多

Class α-proteobacteria

従属栄養海洋細菌
真核細胞ミトコンドリアはこのグループの細菌由来(説) → 細胞内共生
Order Rhodospirillales
Order Rickettsiales (リケッチア)
Anaplasmataceae: 多くは細胞内部でのみ生存可能
= 細胞内共生菌 - 昆虫に高頻度

雄殺し male-killing, 単為生殖 parthenogenesis, 雄の雌化 feminization

Order Rhodobacterales
Rhodobacteriiceae 紅色細菌
細胞光合成色素有 - 主にグラム陰性好気性細菌
Order Sphingomonadales
Order Caulobacteriales
Order Rhizobiales (リゾビウム)
(Hyphomicrobiales 出芽細菌, 統合廃止)
Rhizobiaceae
Rhizobium Frank 1889: 根粒菌
R. leguminasarum (エンドウ、ソラマメ)
酵母エキスマニトール寒天培地培養により2属に分ける

Rhizibium = 生育速く酸産生
Bradyrhizobium = 遅くアルカリ産生

R. phaseoli (インゲン)
R. japonicum (ダイズ)
R. trifolii (シャジクソウ)
R. lupini (Lupinus)
R. meliloti (ウマゴヤシ, シナガワハギ)
Sinorhizobium Chen et al. 1988: 根粒菌(硝化細菌)
Bradyrhizobiaceae
Bradyrhizobium: 根粒菌
Afipia, Agromonas, Blastobacter, Bosea, Nitrobactetr, Oligotropha, Rhodopseudomonas (カロチノイド含む)

Nitrobacter winogradskyi 硝酸菌:
2HNO2 + O2 → 2HNO3 + Energy (HNO2 → NO3)

Cp. Nitrosomonas

Phyllobacteriaceae Mergaert et Swings 2006
Mesorhizobium Jarvis et al. 1997: 硝化細菌 (系統解析 - Rhizobiumから独立)
M. loti Jarvis et al. 1997: Nelumbo nuciferaと共生し根粒形成
Hyphomicrobicaceae
出芽細菌: 出芽 (or出芽 + 縦分裂)
細胞球形-卵形-楕円形-洋梨形。多くは集合体
Methylobacteriaceae (メチロバクテリウム)
Beijerinckiaceae
Methylocystaceae
Rhodobiaceae

Class β-proteobacteria (ベータプロテオバクテリア)

好気性/通性細菌
Order Burkholderiales
Alcaligenaceae
Achromobacter (A. fisheri 発酵菌)
Alcaligenes
Bordetella (B. pertussis 百日咳菌)
Taylorella
Burkholderiaceae
Comamonadaceae: Sphaerotilus (S. nataus = 水質汚染指標)
Oxalobacteraceae: Janthinobacterium (土壌細菌、代謝能多様、低温等ストレス耐性高)
Sutterellaceae
廃止: Chlamydobacteriales, Chlamydobacteriaceae 鞘細菌, 糸状菌(Ex. Sphaerotilus): 細胞は糸状体形成。一般に明瞭な鞘に包まれる。グラム陰性。極鞭毛持つ遊走細胞か不動性分生子生じる。内生胞子非形成
Order Hydrogenophilales
Order Methylophiales
Order Neisseriales
Neisseriaceae: Neisseria (N. grorrhoeae 淋菌)
Order Nitrosomonadales
Nitrosomonadaceae
Nitrosomonas 亜硝酸菌

2NH3 + 3O2 → 2HNO2 + H2O + Energy (NH4OH → HNO2)

Spirillaceae
Gallionellaceae: Galllionolla (G. ferginea 鉄細菌)
Order Rhodocyclales

Class γ-proteobacteria

グラム陰性
病原菌多
Order Chromatiales (≈ 紅色硫黄細菌)
Chromatiaceae
Thiorhodaceae廃止 (Thio-: カロチノイド含む = 光合成行う)
Ectothiorhodospiraceae
Order Actithiobacillales
Order Xanthomonadales
Xanthomonadaceae
Order Cardiobacteriales
Order Thiotrichales
Thiotrichaceae: Beggiatoa (細胞単独性/糸状体。藍藻植物に似るものある(但しクロロフィルなし)
Piscirickettsiaceae
Francisellaceae
Order Legionellales
Order Methylococcales
Order Oceanspirillales
Order Pseudomonadales シュードモナス
旧 Class Schizomycetes 分裂菌(分生菌)綱含む
Pseudomonadaceae シュードモナス
色素生産あっても光合成色素持たない
オキシダーゼ陽性
グルコース代謝能
胞子産生性 + 運動性
Pseudomonas (syn. Chlorobacterium 緑色細菌, 廃止) > 218種

多種有機化合物分解能 (分解者) → 炭素循環/バイオレメディエーション

Azotobacter (A. chroocaccum 窒素固定)
Azomonas Winogradsky (窒素固定)
Order Alteromonadales
Order Vibrionales
Vibrionaceae: Vibrio (Ex. Cholera group) 弧状-螺旋状の棹状 (V. möller, V. comma コレラ菌, V. parahaemelyticus 腸炎ビブリオ
Order Aeromonadales
Order Enterobacteriales (腸内細菌)
Enterobacteriaceae (腸内細菌): Enterobacter, Escherichia coli 大腸菌, Shigella 赤痢菌, Klebsiella (K. pneumoniae 肺炎棹菌), Salmonella (S. typhosa チフス菌), Yersinia, Yokenella
E. coli (Migula) Cast. et Chalm.: グラム陰性桿菌、通性嫌気性菌

名前の通り腸内細菌 → モデル生物
短軸0.4-0.7 μm、長軸2.0-4.0 μm

Order Pasteurellales

Class δ-proteobacteria, nom. nud. (δ-プロテオバクテリア)

Order Myxobacteriales 粘液細菌
栄養細胞薄膜。鞭毛なし。分泌粘液物質上滑走。グラム陰性
括れ分裂。大部分は栄養細胞が集合し子実体fruiting body形成
栄養体は休眠細胞resting cell, microcyst, myxosporeとなり、子実体粘液中に埋もれたりマクロシストmacrocystという嚢中に形成される

Class ζ-proteobacteria

Phylum Firmicutes (グラム陽性細菌門)

= グラム陽性低GC含量細菌

Class Bacilli バシラス

Order Bacillales バシラス
芽胞形成
偏性好気性(一部通性嫌気性)グラム陽性桿菌
Bacillaceae
Bacillus (B. subtilis 枯草菌, B. anthracis 炭疽菌) – 細胞は真直ぐな棹状
Planococcaceae
Caryophanaceae
Caryopahales 廃止
Caryophanon (C. latum – 細胞円柱状-円板状。グラム陽性。ゴニジア)
Listeriaceae
Staphylococcaceae: Staphylococcus, Staphylococci (S. aureus 黄色ブドウ球菌), Gemella, Macrococcus, Salinicoccus
Sporolactobacillaceae
Paenibacillaceae
Alicyclobacillaceae
Thermoactinomycetaceae
Order Lactobacillales (ラクトバシルス)
Lactobacillaceae ラクトバシルス
Lactobacillus: L. apodemi (タンナーゼ産生), Paralactobacillus, Pediococcus
Aerococcaceae
Carnobacteriaceae
Enterococcaceae エンテロコッカス
Enterococcus: 腸球菌・乳酸菌
Leuconostocaceaae
Streptococcaceae (連鎖球菌)
Streptococcus: S. gallolyticus(タンナーゼ産生),S. lactis 乳酸発酵菌(連鎖球菌), S. mutans 虫歯菌, S. pyogenes 化膿連鎖球菌, S. pneumoniae, Syn. Diplococcus pneumoniae 肺炎球菌
Lactococcus
incertae sedis: Acetoanaerobium, Oscillospira, Syntrophococcus

Class Clostridia クロストリジウム

Order Clostridiales クロストリジウム
主要腸内細菌(全種ではない)
Clostridiaceae
Clostridium Prazmowski 1880: C. tenani 破傷風菌, C. botulinum ボツリヌス菌
Order Thermoanaerobacteriales
Order Halanaerobiales
Order Natranaerobiales
Order Thermoanaerobacteriales
多系統群

Class Erysipelotrichi エリュシペロトリクス

Order Erysipelotrichales

Class Negativicutes ネガティウィクテス

従属栄養性、偏性嫌気性、グラム陰性
Order Acidaminococcales アキダミノコックス
Order Selenomonadales セレノモナス
Order Veillonellales ベイロネラ
Veillonellaceae Rogosa 1971
Veillonella parvola: ヒト、ラット、ウサギの口腔・腸管

Class Thermolithobacteria Sokolova et al. 2007 テルモリトバクテル

Order Thermolithobacterales
Thermolithobacteraceae: Thermolithobacter (鉄還元する偏性嫌気性菌)

Class Limnochordia Watanabe et al. 2015 リムノコルダ

Class Tissierellia ティッセレッラ

Phylum Tenericutes テネリクテス

Class Mollicutes モリクテス

細胞壁欠く = 微小 + 動植物寄生
Order Mycoplasmatales マイコプラズマ (Classとして分類)
一般の細菌が持つ細胞壁欠く (ウイルスも欠く) - 特異的
無細胞培地で増殖 → コロニー非常に小 ≈ 250 μm-1 mm 肉眼識別困難。培地に血清や腹水を加えるのは多種でステロールsterol合成能力がないため
多様。運動性なし。グラム陰性
生殖不明 (基本的に2分裂増殖 - 大きさ、形まちまち)
Mycoplasmataceae マイコプラズマ
Mycoplasma, incertae sedis: M. pneumoniae 原発性異型肺炎病原体
Erysipelotrichaceae: Erysipelothrix AL, Holdemania
Order Entomoplasmatales エントモプラズマ
Order Acholeplasmatales アコレプラズマ
Acholeplasmataceae
Ca. Phytoplasma Firrao (ファイトプラスマ)
Order Anaeroplasmatales アナエロプラズマ
Order Haloplasmatales ハロプラズマ

Phylum Actinobacteria (アクチノバクテリア. 旧, 放線菌)

グラム陽性。DNA中GC含量高い菌種含む(= 高GCグラム陽性菌)

Class Actinobacteria

Subclass Actinobacteridae

Order Actinomycetales (放線菌)
栄養体多少とも分枝した菌糸体生じるが菌糸幅 < 1.5 μm。グラム陽性
栄養菌糸 vegetative mycelium (基底菌糸 substrate mycelium)と立ち上がった気菌糸 aerial mycelium 持つ
増殖: 菌糸断裂、分生子や胞子嚢形成等 (adj. actinorrhizal 放射菌の)
Suborder Actinomycineae
Actinomycetaceae
Suborder Corynebacterineae
Corynebacteriaceae
Dietziaceae
Gordoniaceae
Mycobacteriaceae: Mycobacterium (M. tuberculosum 結核菌, M. leplae ライ病菌)
Nocardiaceae
Tsukamurellaceae
Williamsiaceae

Subclass Rubrobacteridae

Order Rubrobacteriales
Suborder Rubrobacterineae
Rubrobacteriaceae

Subclass Coriobacteridae

Order Coriobacteriales
Suborder Coriobacterineae
Coriobacteriaceae

Subclass Sphaerobacteridae

Order Sphaerobacterales
Suborder Sphaerobacterineae
Sphaerobacteraceae
Suborder Frankineae
放線菌群から独立
Frankiaceae フランキア
Frankia Brunchorst: Alnus等に共生し空中窒素固定 - ホスト不在なら単独生活可能

nifD-K: フランキア特異的

Geodermatophilaceae
Microsphaeraceae
Sporichthyaceae
Acidothermaceae
Kineosporiaceae
Suborder Micrococcineae
グラム陽性土壌細菌
Micrococcaceae
Bogoriellaceae
Rarobacteraceae
Sanguibacteraceae
Brevibacteriaceae
Cellulomonadaceae
Dermabacteraceae
Dermatophilaceae
Dermacoccaceae
Intrasporangiaceae
Jonesiaceae
Microbacteriaceae
Beutenbergiaceae
Promicromonosporaceae
Suborder Micromonosporineae
Micromonosporaceae
Suborder Propionibacterineae
Propinibacteriaceae
Nocardioidaceae
Suborder Pseudonocardineae
Pseudonocardiaceae
Actinosynnemataceae
Suborder Streptomycinae
Streptomycetaceae
Suborder Streptosporangineae
Streptosporangiaceae
Nocardiopsaceae
Thermomonosporaceae
Order Bifidobacteriales (ビフィドバクテリウム)
Bifidobacteriaceae
Bifidobacterium ビフィズス菌(俗)

B. longum BB536 (特定保健用食品, 森永)

Phylum Planctomycetes

Class Chlamydiae

Order Chlamydiales
Chlamydiaceae
Parachlamydiaceae
Simkaniaceae
Waddliaceae

Phylum Spirochaetes

Class Spirochaetes

細胞細長く5-500 μm, 柔軟、屈曲性あり最低1回螺旋を巻く
グラム陰性菌。横分裂
Order Spirochaetales 螺旋菌(スピロヘータ)
旧科名 Treponemataceae廃止
Spirochaetaceae: Borrelia (B. recurrentis 回帰熱ボレリア), Treponema (T. pallida 梅毒菌)
Serpulinaceae
Leptospiraceae: Leptospira (L. icterohaemorrhagiae 黄疽出血性レプトスピラ)

Phylum Fibrocacteres

Phylum Acidobacteria (アシドバクテリウム)

培養困難: 2綱11属17種 (2009)

環境中16S-rRNAから推定される多様性は大
推定: 真正細菌中で大型の門

土壌試料中からよくAcidobacteria配列見出される

Phylum Bacteroidetes (バクテロイデス)

グラム陰性菌
腸内細菌叢主要構成菌(水系、土壌等にも分布)

Class Bacteroides

Order Bacteroidales
Bacteroidaceae
Rikenellaceae
Porphyromonadaceae
Prevotellaceae

Class Flavobacteria

好気性桿菌 (2–5 μm × 0.3–0.5 μm)
GC含量 = 32-37%
Order Flavobacteriales
Flavobacteriaceae

Class Sphingobacteria

Order Sphingobacteriales
Sphingobacteriaceae
Flexibacteraceae

Phylum Fusobacteria (フソバクテリウム)

Class Fusobacteria

Order Fusobacteriales
Fusobacteriaceae

Phylum Verrucomicrobia

Phylum Dictyoglomi

成長・増殖 (growth)


単細胞生物: 個体形態的変化(突然変異除けば)なし = 未分化の連続的変化
= 個体群 populationとして扱うのが普通

ただし、B. subtilisは内生胞子1つであり、クローンにより増やしたコロニーを調べると遺伝的制御が確認される。また、コロニーは螺旋を描きながら増えるので、その機構が調べられている

測定法
1) 物質量の変化

a) 乾燥重量、総N量、タンパク質N量
b) 濁度
c) 容積

2) 細菌数(1より直接的)
a) 生菌数 viable counting
b) 総菌数 counting total cell number (total count) growth

顕微鏡下で一定区画内の菌数を数える。実際には死菌をも数えるため過大評価となる

i) Helber chamber, Retroff Houser等を利用
ii) membrane filterを使用

貧栄養湖等では菌数が極少 → 濾過濃縮してから検鏡

iii) 粒子測定器coulter counter使用 – 細菌数測定以外にも利用

膜間に電圧をかけておき、そこを細菌が通過すると微少であるが抵抗が増す。その電位差ΔV(通過した細菌数に比例)の度合いから粒子数(菌数)を測定
growth 体積推定もできる(誤差大)
ΔE/E = ΔR/R (E: 電圧, R: 抵抗)


              長さ  面積  比抵抗

L     A     ρ0
        細菌    l     a     ρ

孔に平行に細菌は通過したと過程(これと実際の通過経路とのずれが大きいほど誤差は大)
R = ρ0L/A·ρl/a
ΔR = /A2(ρ/(ρρ0) – a/A)-1 (v: 細菌の体積)
∴ ΔE/E = ΔR/R = v/V(ρ/(ρρ0) – a/A)-1 (V: 体積)

aAより十分小さいと仮定

= v/V·(ρρ0)/ρv/V

[一般成長式]

成長曲線 growth curve

N: 細菌数/物質量
growth 0-A: 誘導期 lag phase
A-B: 対数期 log phase(増加直線) or 指数期 exponential phase
B-C: 定常期 stationary phase: 一般にはこの相で終わる
C-D: 減衰期 decline phase (= 死滅期 logalithmic death phase)
Lag phaseの存在
- なぜ存在するのか
細菌は濃くするとlag phase短い → 前のコロニーに何か原因があるらしい
定常期の存在は栄養の枯渇が第一原因 + 他に代謝産物の蓄積等
最大個体群成長サイズは種により決まっているが、この原因は不明
増殖速度 growth rate
細菌分裂時間は条件が揃えば大体決まっている = 平均世代時間 T
最初n0個体存在 → t時間後n個体となる
n = n0 × 2t/T
→ logn – logn0 = t/T·log2 ∴ (logn – logn0)/t = log2/T
growth growth

Δn/(logn2 – logn1)/(t2t1) = log2/T

このようにして平均世代時間Tは求められる
実際はt = t2t1となる増殖過程(のある区間)をとることが多い。

比増殖速度 specific growth rate
dn/dt = kn (k: 比増殖速度 constant = 1/n·dn/dt)
n = n0ekt
ln(n/n0) = kt → lnnをもとに対数プロット → 傾き = k/2.303

growth

2.303(lnn – lnn0) = kt
前式からlog2/T = k/2.303 ∴ T = 0.693/k
一般に下記のように表わす

細菌数 n: k = 1/n·dn/dt
物質数 μ: μ = 1/x·dx/dt

lag phaseについて:
(logn – logn0)/(tL) = log2/T (T, L: 変数)

→ lag phaseでの測定よりT, Lは求まる

1949 Monod: log2nを縦軸とする = 2倍時間 double time

n代目はlog2n0 + nで表わせる(最初は0代)

1955 Finey: 2を底とする対数表作る (結局無駄)

最大生産量 maximum population or yield

growth 逆に最大生産量から制限基質の濃度を知ることができる(生物検定, 生物試験法 bioassay)
vitamins, amino acids, purines, pyrimidines, etc.で広く生物検定は利用される
(生成した細菌量)/(消費された制限基質量) = Y

Y: 収量 yield (収量定数, yield coefficient or constant)

モル増殖収量 molar growth yield

1モルの制限基質で増殖できる菌数 = 生成ATP数 [反論: 定量的関係はない]

連続培養 continuous culture

細菌をある定常状態に保っておく培養方法
齢の揃ったものを連続的に集められる利点がある
Ex. バッチ法

μ = (1/x)·(dx/dt) 基質依存 → cf. Michaelis constant: v = V·S/(KM + S)
μ = μm·s/(KS + s) … (1)
sを変える → μ = 0 - μm

KS: saturation constant
s: substrate concentration
μm: maximum μ at saturation (= μmax)

増殖と基質濃度
dx/dt = -Y·(ds/dt) … (2)
Y = -dx/ds (Y: yield constant)
D = f/V (h-1)

D: 希釈率 dilution rate, f: 流速 (ml/t), V: 培養液の濃度(m/V)

1/D (hr): 存在時間となる
もし細菌が増殖しないと洗い出される:

洗い出しの速度 –dx/dt = Dx (槽内の菌数) … (3)

増殖していると:
dx/dt (槽内の変化) = μx (増殖) – Dx (洗い出し) … (4)

状態_定常状態_______菌数増加__菌数減少(洗い出し)
μ____= Dxdx/dt = 0___> D________< D

基質がSR(濃度)で入いる: 一部消費されsで出て行く
ds/dt = DsRDsμx/Y … (5)
(1), (4)より dx/dt = x[μm·s/(Ks + s) – D] … (6)
(5), (6)より ds/dt = D(SRs) – μm/Y·s(Kss) … (7)
定常状態の時: dx/dt = 0, ds/dt = 0 ∴ μm·s/(Ks + s) = D
D(SRs) = μmx/Y·s/(Ks + s), Y(SRs) = x, s = Ks·D/(μmD)
μm, Ks, Yが分かればx(菌数), sが分かる
x~ = Y(SRs) = Y{SRKs·D/(μmD)}, s~ = Ks·D/(μmD), W~ = x~
洗い出し: DW~ = Dx~
Km = μm, Sk = ks

同調培養 synchronous culture

t: 平均世代時間mean generation time = T → 個体群: 様々なステージ

growth
(理想)同調培養

a) 濾過によるサイズ調整 sorting of size by filtration

Seitz filter (Cu製, Ptメッキ)

Upper layer: Toyo filter #1, 2 layered, Lower layer: Toyo filter #126, 18 layers, etc.

E. coli, lag phase 1 l → final 2 ml (10'' cells)濃縮, 50 mlの培地を2.5 ml/secで洗い出す

Small-sized bacteria__________Large-sized bacteria
growth

b) 遠心によるサイズ調整 sorting of size by centrifugation
ショ糖密度勾配法 SDG method (Mitchison & Vincent 1965)

10-40% 500 g, 10 min → large cells, 4% of total bacteria
2-12% 2500 g, 20 min → small cells (top fraction), 2% of total
_____________________bacteria

c) 齢選択 age selection
Ex. Millipore filter (type GS)

菌が引っかかる____rinse: 分裂後の若い細胞を集める growth

d) 誘導技術 induction techniques i) 温度: 温度変化で同調
ii) 光illumination: 光強度を変える
iii) 飢餓starvation: 貧栄養 → 富栄養

同調細菌より酵素(ATC, asparate transcarbamylase)抽出 → 活性高い → 酵素生成も同調している

同調培地での増殖(成長)
固形培地で成長測定は困難だが、コロニーカウント及び純粋培養によりコロニー形態観察には便利
成長の化学的(栄養的)条件

化学栄養細菌類: 無機塩類、CO2、(光)
人工培地で育たない細菌も存在し、栄養要求性は多様である。乳酸菌、梅毒菌は栄養要求性が細かい
Ex. E. coli: 無機塩類 + ブドウ糖 = 最少培地 minimum medium

1) 培地 medium
合成培地 synthetic medium: 組成明らか
完全培地 complete medium
自然培地 natural medium: 組成不明物含

Ex. molt extract, meat extract, peptones, potato extract, milk, yeast extract

栄養培地 nutrient medium
Haemophilus sp. (= blood必要): for H. influenzae ()内がbloodで必要なもの

___________________X factor_______V factor
H. influenzae___________+____________+
H. parainfluenzae__– (ヘミン, Fe)__+ (NAD, NADP)

2) 無機塩類
細菌の構造を保つ
  • metal: enzyme
  • Zn: Alchohol DH
  • Mg: Phosphohydrase
  • Mn: Arginase, Isocitrate DH
  • Fe: Various enzymes
  • Cu: Tyrosinase, Cytochrome oxydase
  • K: Pyruvate phosphokinase
  • Na: Membrane ATPase
  • Se: Hydrogenase, Gly reductase
3) 炭素源 carbon source
最も普通な炭素源はD-glucose

利用できない細菌も結構いる Ex. Vibrio ABE-1, Flavobacterium
利用できないのはpermease hexolcinaseが無いからと言われるが未詳

4) 窒素源 nitrate source
アミノ酸合成に必須
5) 発育系 growth factor (≈ bacterial vitamin)
生理的活性必要有機物 = 生理的活性が可能となる最低限があればよい。主に補酵素co-enzyme
(アミノ酸等で自身で合成可能なもの、構成要素として存在するものは発育系と言わない)
Inositol: fungi, yeast, Actinomyces israelii (細菌ではこの種のみ)
Choline (恐らく膜形成に関与): Pneumococii, Mycoplasma (inositolも必要)
Oleic acid (C18:1): Clostridium diphtheriae
Vitamin

生態 ecology


微生物叢/細菌叢 microbiota

= 微生物集団

マイクロバイオーム microbiome: ある範囲での微生物全体
⇒ 微小生態系 microcosm: 微生物を含めた微小な生態系 Ex. 水溜り、金魚鉢

水と湿度

微生物は、常に水を介してO2, CO2などの気体を摂取する (乾燥土壌でも微生物は水の膜を介して気体を摂取)
腐敗や発酵は、基質に含まれる水が関係 - 微生物生育に水分不可欠
基質中水分は、形態から結合水、自由水に分類

結合水: 基質構成成分であるタンパク質や炭水化物と固く結合した水
自由水: 環境や温度、湿度の変化で容易に移動や蒸発がおこる水 = 微生物繁殖利用可能な水

自由水の割合 = 水分活性 water activity (aw) = 蒸気圧 vapor pressureを測ればよい(Scott 1953)

水分活性: aw = P/P0 → 溶液蒸気圧(P)と純粋蒸気圧(P0)の比

概ね基質平衡相対湿度(ERH)の1/100 → aw = P/P0 = ERH/100
一般にaw = 0.63-0.99
細菌(含藍藻・動物プランクトン)は上限に近い値でないと生活できない
aw < 0.5: 殆どの微生物増殖抑制

好乾性 xerophilic: 陸上植物、サボテン、トノサマバッタ
好湿性 hydrophilic: 細菌、菌類(cf. xerophilic fungi, aw < 0.63)

表 水分活性値と微生物の関係
  • 水分活性: 微生物 = 食品/水分(%)
  • 0.950: E. coli, Pseudomonas, Proteus, Shigella, Klebsiella, Bacillus, Clostridium, Perfringens, some yeasts = 生鮮果実・野菜/87. ソーセージ/69-66. パン/35. かまぼこ/73-70
  • 0.910: サルモネラ菌, ボツリヌス菌, コレラ菌, 腸炎ビブリオ, Serratia, Parahaemolyticus, Phicia, Lactobacillus, Pediococus, Rhodotorula = チーズ/40. ハム/65-56。果汁/88-66
  • 0.870: 酵母 (Candida, Torulopsis, Hansenula), Micrococus = シラス干し/59. サラミソーセージ/30. スポンジケーキ/25. 塩鮭/60
  • 0.800: カビ(mycotoxigenic Penicilla), 黄色ブドウ球菌, most Saccharomyces (baillii) spp., Debaryomyces = 米/14-13. 豆類/−. イカ塩辛/64. フルーツケーキ/−
  • 0.750: 好塩菌, mycotoxigenic Aspergilli = ジャム・マーマレード/30. 蜂蜜/16. 醤油/−
  • 0.650: 耐乾性カビ (Aspergills chevalie, A. candidus, Wallemia sebi), Saccharomyces bisporus = 裂きイカ/30. ゼリー/18. 干しエビ/23
  • 0.600: 耐浸透圧性酵母 (Saccharomyces rouxii), カビ数種 (Aspergills ecbinulatus, Monascus bisporus) = 乾燥果実/17-15. 煮干し/16. 小麦粉/14-13
  • < 0.500: 増殖不可 = 麺類/12. 全卵粉末/5. クッキー・クラッカー/5-3. 乾燥野菜/5<
浸透圧
好塩菌
水分の多い所 = 普通低張な所に住む

Ex. グラム陽性菌 = 20 atm, グラム陰性菌 = 5-10 atm.

広塩性 euryhaline: 浸透圧変化に広い耐性

↔ 狭塩性 stenohaline: 耐性範囲が狭い

細菌表層は丈夫(例外: Mycoplasma – 細胞壁ない)

Cf. 菌類菌糸 – burstしない: 内部浸透圧を下げburst避ける, プロトゾア– 積極的排水, 花粉発芽

水圧 water pressure
1万m以下の深海で生存可能な細菌存在 → 100-160気圧で成長異常 = 一概に好圧性barophilicか不明

Ps. bathycetes, 1000気圧, 3°C → Lag phase = 4 months, generation time = 33 days, stationary phase = 1 yr?
E. coliに圧670 atm → translocation部が圧に敏感でinitiation step働かない。転写は余り影響受けない
Ex. β-galactosidase(誘導酵素)

growth
細菌は圧をかけてから酸素は生産していない → translation部位の影響

Ex. 多価アミラーゼ: 6000 atm/cm2にすると変性する

pH (pH)
普通の細菌はpH 5-9.5程度が最適 (≈ 0という分類群もいる)
好酸性細菌 acidophilic bacteria

Thiobacillus → H2SO4, Acetobacter → CH3COOH
代謝産物がH2SO4やCH3COOH等の細菌は必然的にacidophilicになる

好塩基性細菌 alkalophilic bacteria

Bacillus alkalophillus (ca pH 11), B. alkaliphillus → 多量のNH3を必要

1942 Gale EF

E. coli, amino acid dehydrogenase → 塩基性, Deaminase → 酸性
growth
→ 細菌が環境を都合のよいように変えうる

温度 temperature
基本的温度 ordinal temperature
a) 熱致死温度 thermal death temperature

→ 液体培地(水溶液)中で10分おくと死ぬ時の温度
実際は測定困難 → 変わりにthermal death temperatureを用いること多
Ex. 無胞子性細菌: 湿熱 hydration = 47°C – 数時間, 60°C – 1時間, 70°C – 5分, 80°C – 2-3分 (例外は多い)
乾熱では非常な高温に耐えることが多い。Ex. 160°C – 1時間

b) 最小温度 minimum temperature

凍結防止剤 anti-freezerを加え凍らせず測定
Ex. 30°Cで増殖させると極めて効率が悪い= 測定困難

c) 最適温度 optimum temperature:

成長に最適な温度 – 成長率曲線より求める

d) 最大温 度maximum temperature: 測定自体は容易

最適温度: 理論上左右対称
タンパク質や脂質変性により温度上部で成長止まる
growth
変性なければ最大温度はもっと上

菌根ヘルパー細菌 mychorrhiza helper bacteria, MHB

1994 Garbaye: [定義] 菌根菌の菌糸生育と植物-菌根共生を促進する細菌
2005 Schrey et al.: Streptomyces - 菌糸伸長

促進 -菌根菌(ベニテングタケ) ↔
阻害 - 植物病原菌(Armillaria obscura, Heterobasidion annosum)

2009 Kataoka & Futai

クロマツ菌根圏: Bacillus, Ralstonia


微生物群集 microbial community

群集解析
0. 成長測定応用

a) コロニー培養: 培養困難な細菌では不可
b) 染色細菌数カウント: 細菌数のみの情報

1. FISH: プローブ配列設計必要
2. DGGE: バンドパターンのみ
3. 遺伝子解析
a) メタ16S/18S解析:
16S/18S rRNA - 遺伝子配列解析進む ⇒ 配列データベース

細菌等からゲノムDNA調製し16S rRNA該当領域の塩基配列解析 - データベース利用し分類群推定可能

利点: 安価、少量、系統組成
欠点: PCRバイアス, 分解能(属まで), 系統機能不明
生物多様性 biodiversity ∝ アンプリコン配列 16S amplicons多様性
機能的冗長性 functional redundancy: metagenomeを介し測定

biodiversity ∝ function (or redundancy)
仮定: 高い多様性は高いresilience (or redundancy)を持つ

b) メタゲノム解析
利点: 系統組成/遺伝子機能、バイアス稀
欠点: 参照配列依存、目的依存

始原菌 Archaebacteria


遺伝子とそれに伴うタンパク質は高等生物に近い - 真正細菌から独立

⇒ 分類群 (taxa)

環境 (environments)

1)温度

好熱菌 (好熱性細菌 tempmophilic bacteria)
多くは温泉、深海熱水孔付近で発見: 深海 = 高圧 → 100°C以上の水存在

40-100°C: 好熱性細菌(普通は70deg;C程度で成長) → 超好熱菌: 100deg;Cで働く酵素を持つ

Pyrolobus fumarii: 121°Cのオートクレーブ処理でも死なない

8-50°C: 中温(常温)菌 ≠ 始原菌
< 20°C: 好冷菌 ≠ 始原菌

高温耐性 = 「膜、酵素」系機構解明重要(常温-低温で生存できない原因未詳)
細胞抽出物cell free extractを煮ても変性しない
1. タンパク質(酵素含む)自身が熱に安定 - PCR (1993 Mullis ノーベル賞)

熱安定 thermolysin: 表面に2、内部に2のCa++の存在。Ca++を除くと熱失活する
Glu synthetase = 70C, 5 hrでも100%活性がある (Ca++, Mg, Mn, Substances = L-Glu, NH4Cl)
α-amylase – Ca++
Thermus aquatics: 常温で不活性 = 37°Cでは生存できない

aldolase = optimum temperature 95°C (97°C 20' 100% active)
endolase = o.t. 85C (85°C, 120', 100% active)
+ RNA, DNAにも熱耐性 – G/C content

2. 安定化させる要因存在: 膜構造 - 脂質組成異なる?

一部の細菌では脂肪酸が熱に安定な糖脂質に置き換わっている

3. 補修早い(証拠なし) ↔ 好冷菌: 殆ど不明
2) pH
3) 塩分
弱好塩性生物: 1-6% NaCl ⇔ 中好塩性生物: 6-15% NaCl

⇔ 超好塩性生物: > 15% NaCl

高度好塩菌 = 好塩性 (塩漬保存は高濃度塩中で通常微生物が増殖できないことを利用)
死海(イスラエル)、グレートソルト湖(米国)等の塩湖、天日塩・岩塩中から分離

低好塩性 ___ 2-5% NaCl (海水3.3-3.7%)
中好塩性 ___ 5-20
高好塩性 ___ 20-30 (NaCl 4 M = 23% at 20°C)

細胞内外の塩濃度差は1000倍にもなる

P = CRT = 4 × 0.082 × 293 = 96.104
→ NaCl解離度合考慮(等張係数 = 1.71)
∴ 96.104 × 1.71 ≈ 164 atm
この範囲でないと生存できない(普通なら原形質分離値)。好塩性細菌はNa+, K+の盛んな取り込みを行なう

1970 Matula et al. (信頼性低)

Pseudomonas B16 (low halophilic bacteria): [Inner] Na+, Cl+ ≈ Outer solution, [Innter] K+ > Outer solution → K+が10-30倍に濃縮
[Innter] K+ > Outer solution → K+が10-30倍に濃縮
高好塩細菌ではK+が細胞内に100倍以上に濃縮される


            NaCl (M)          外液  細胞内  比率(%)

Pseudomonas B16    0.3   0.123    41
        中  Vibrio costicola   1.0   0.684    68.4
            Ps. 101            1.0   0.90     90
            Paraeocus          1.0   0.311    31.1
        高  Ps. sp.            4.4   0.62     14.1
            Salcina morrhuae   4.0   3.17     70

統一法則性見出せない。Na+が機能的なもので浸透圧調節のために取り込んでいるのではない(Na+の代わりにK+, sucuroseを入れても取り込まない)
→ Na+の関与: 物質取り込み、構造維持、酵素の働き(酵素調べれば分かる)
Micrococcus halodemitrificans = 中好塩性細菌

Ex. 1. Succinate DH
Archaebacteria
Ex. 2. Cytochrome oxidase (両実験とも精製酵素ではない)
Archaebacteria
好塩性細菌タンパク質は一般に酸性のものが多い
仮説

Archaebacteria

低張度ではgNaで外へ捨てる。細菌では、外周近くが高濃度で中央に行くにつれ低濃度になる
同じ細菌でも表皮近くと内部でNaに対する酵素性質異なる → 細菌でも酵素性質がその分布により異なる

1978 Brown AD: 多数カルボキシル基を有する

K+と結合したもの活性あり → 非結合のが非活性

______→ -K+
inactive ↔↔↔↔ active
______← +K+

非好塩性細菌タンパク質でも、コハク酸等を使いアミノ基をカルボキシル基と置換させると好塩性時に活性化タンパク質となることもある

好塩性細菌リボゾームタンパク質 halophilic bacterial ribosomal proteins, HBRP

酸性 = 塩必要な1要因
E. coli (通常菌)

haplophilic → 19 proteins + rRNA

→ 35 proteins + rRNA

Halobacterium (好塩菌)

haplophilic → 19 acidic proteins + rRNA

→ 35 acidic proteins + rRNA: K+が必要となる

始原菌: 5S RNA → 酸性タンパク質多
進化的なもので好塩菌に限らずHBRP存在し一概に塩を好むからHBRPがあるとはいえない

レチナールタンパク質: 膜タンパク質 – 光感受性

バクテリオロドプシンにより光エネルギーを用いてプロトンを汲み出す → プロトン勾配形成
= 電気化学ポテンシャル → ATP合成、Na+排出

4) 圧力
耐圧生物: 大気圧以上でも生存はするが増殖は見られない

_好圧生物: 中程度の圧力条件下(10-80 MPa)で増殖
_超好圧生物: 高圧条件下 (> 80 MPa)で増殖

メタン生成菌 (メタン産生菌) methane-producing bacteria

絶対嫌気性菌 (酸素存在環境で殖えない性質)
実験培養困難: 特殊ガラス容器に培養液入れ、圧力かけ水素ガス注入し閉栓 → 孵卵器内で培養
化学反応(メタン生成)でエネルギー獲得する生物 = 系統分類群ではない

Ex. 球菌 + 桿菌。運動性細菌 + 非運動性細菌
Ex. グラム陽性菌 + グラム陰性菌。+ 好熱菌

湖沼・海洋底泥(ヘドロ)、湛水水田土壌、反芻動物第1胃(ルーメン)、シロアリ後腸、嫌気発酵汚泥、温泉源・深海熱水噴出口等から分離 → 有機物最終分解者
独立(化学)栄養細菌: 炭水化物、タンパク質または有機物等をエネルギー源に使えない → メタン醗酵

利用栄養分は、水素、蟻酸、酢酸、CH3OH等の低分子物質
メタン発酵: 水素、蟻酸、酢酸やメタノールを酸化し出る電子を用いCO2を還元しメタン生成

水素や蟻酸 → メタン: Methanobacterium
酢酸やメタノール → メタン: Methanosarcina
水素、酢酸や酪酸 → メタン: Methanococcus

メタン生成経路: 他生物にない6補酵素が使われる

メタノフラン (MFR), テトラヒドロメタノプテリンZ (H4MPT), 補酵素M (HS-CoM), 補酵素B (HS-CoB), 補酵素F420 (F420, Maxabs = 420 nm + 蛍光 → 顕微鏡下で他細菌との区別に有効), 補酵素F430 (F430)

メタン菌
= 自然界メタン生成主要因 ↔ 人工増殖困難 → ドブ環境 = 好適環境(自然生態系壊すと復元困難)
中温性メタン生成細菌 = 増殖遅 → 多くの生理生化学的研究は高温性メタン生成細菌で行う
偏性嫌気性 = 増殖遅い → 取り扱い難しく生態的研究遅れる
嫌気リアクター発生メタンガス = エネルギー源 → 他環境からの発生メタンガスは大気放出 = 温暖化
メタン菌による生活排水浄化
生活排水 → 下水道管 → 下水処理場 → 雑物除去 → 微生物活性利用し有機性物質分解* → 放流

*浄化 = 微生物処理: 微生物と空気の接触をよくし好気性微生物の勢い強める → 分解速度早まる

浄化 → [残渣 = 多くの沈殿物発生] → 通常、焼却し灰化か、醗酵させ肥料
残渣を嫌気的環境にしメタン菌を増殖させるメタンガス変換施設 → 飲料可能水と僅かな残渣のみに変換可
メタン生成細菌 vs 水素生成細菌
共通点: 嫌気性細菌 ↔ 相違点: 性質 - 特に利用する栄養分は異なる
メタン菌 ↔ 水素生成菌: 炭水化物やタンパク質等高分子を好んで利用するが、酢酸等利用できない
水素生成細菌は、メタン菌と違い、セルロース等固形物を構成成分であるブドウ糖まで分解し、ブドウ糖を水素、CO2と酢酸に変換
水素は水素燃料電池で電気変換可 + CO2は光合成微生物でデンプン変換可

アメーボゾア (Amoebozoa)


Phylum Myxomycota (Myxobionta) 変形菌(粘菌)植物門

古くはEumycota下に置く - 現在独立
生活史: 栄養生活相(アメーバ)-生殖相明瞭 = 偽変形体pseudoplasmodiumか変形体plasmodium形成

生活環の一時期にアメーバ相を持つ。別時期に肉眼で見えるキノコ様胞子嚢を形成し胞子散布する

生殖: 被膜した胞子sporeを用いる。包嚢cyst形成
従属栄養 = 光合成能力なし → 真菌植物、原生動物に類縁関係求められる 変形菌和名: かつてはムラサキホコリカビ等、ホコリカビを最後につけたが、近年は変形菌は菌類ではないことからカビを落とし、ムラサキホコリ、サビホコリ等となりつつある
系統 phylogeny
63属400種程度
              アラクシア型                    ディクチオ型
              細胞性粘菌    真性粘菌          細胞性粘菌
                ↑              ↑             ↑
    寄生粘菌類  │          エキノステリウム  アシトステリウム
      ↑        │              ↑             ↑
      │        │              │ ┌----------┘
      │        │          原生粘菌類        ラビリンチュラ類
      │        │              ↑             ↑
    ----------------------------------------------------------
    (植物的) ←          鞭毛プロチスタ         → (動物的)

Class Acrasiomycetes アクラシス

Order Acrasiales アクラシス
腐植土壌中、植物遺体中、糞中等
栄養生活相: 単核アメーバ → 細菌や菌類を捕食し増殖

リマックス型: アメーバ細胞は1葉状仮足出し運動速度速く、細胞の前後の区別が明瞭
飢餓状態 → 集合し柄も胞子も細胞性の子実体形成

生殖: 偽変形体pseudoplasmodium形成。累積子実体sorocarp形成(有性生殖、不明点多)

Dictyostelium
Fig. 1. Life cycle of D. discoideum

Dictyosteliaceae
Dictyostelium, Polysphondylium

Class Labyrinthulomycetes ラビリンチュラ

Order Labyrinthulomycetes ラビリンチュラ(網状粘菌)
有性生殖未詳
栄養生活相: 単核アメーバの緩い網状群体。網状群体の一部にアメーバが集まり休眠胞子塊形成
Labyrinthulaceae
Labyrinthula

Class Myxomycetes 変形菌

= 粘菌類(古くは動菌Mycetozoeaとも呼ぶ)
栄養生活相: 複相核を持つ変形体plasmodiumと呼ぶ裸の原形質
生殖: plasmodiumより1-多数の子実体形成。ここに多数の被膜胞子を作る。胞子は発芽し単相・単核アメーバmyxoamoebaか遊走細胞生じ、接合し複相核形成し、その後分裂を伴わない核分裂で再び変形体となる

Subclass Ceratiomycetidae ツノホコリ (原生粘菌)

Order Ceratiomixales ツノホコリ
胞子は子実体表面微(小)突起mucroに1個ずつ外生的に形成
成熟胞子は4個の単核相を含み、胞子は発芽し4核を持つ1個の原形質塊を生じ、有糸分裂後に8個の遊走細胞を生じる。減数分裂は胞子中で行なう
Ceratiomyxaceae ツノホコリ
Ceratiomyxa

Subclass Myxogastromycetidae 真正変形菌 (真正粘菌)

胞子は外皮peridiumに包まれた子実体中に内生的に形成
子実体: 形状から胞子嚢sporangium、ばん曲子嚢体plasmodiocarp、塊状子嚢体aethalium等に区別
胞子は1個の単核相を含み発芽し、1-2個の粘液アメーバ(or 遊走細胞)生じる
Order Liceales
Order Echinosteliales
Order Trichiales
Order Physarales
Physarum モジホコリ
Order Stemonitales
Subclass Stemonitomycetidaeとする見解 Stemonitaceae
Stemonitis ムラサキホコリ

Phylum Plasmodiophoromycota ネコブカビ

維管束植物根に細胞内寄生 → stachelとrohrと呼ぶ特殊オルガネラが出現し宿主細胞内へ侵入
宿主枯死後、子実体から胞子を土上に散布
雌雄の胞子zoosporeが融合しできた2倍体のplasmodiumが増殖
不等鞭毛2本
マスチゴネマmastigonemeなし

Class Plasmodiophoromycetes ネコブカビ

Order Plasmodiophorales ネコブカビ

[protocol]

微生物学実験 (experiments on microbiology)


グラム染色 Gram stain(ing)

細菌分類鍵である細胞外壁層を色素染色する方法(改良法多)
= 陽性・陰性は構造(+ 生理機能)の違いを反映したもの
細菌分類基準
グラム陽性 gram-positive: 紫色に染まる

ペプチドグリカン層厚 → 染まりやすい

グラム陰性 gram-negative: 紫色に染まらない = 赤く見える

ペプチドグリカン層薄 + 外膜有する → 染まりにくい
事後、陰性であればサフラニン染色等を行うことがある

細菌株分け (strain observation and separation)


実習 (strain observation)

材料
  1. Bacillus subtilis 枯草菌: 最適成長温度 optimum growth temperature (OGT) = 37-40°C (B. natto, B. mensatricus: 2種に分類, 現在同種)
  2. Escherichia coli: OGT = 37°C
  3. Serratia marcensens 霊菌: OGT = 24-30°C
  4. Staphylococcus aureus 黄色ブドウ球菌: OGT = 37°C
  5. Micrococcus agilis 単球菌の1種: OGT = 25°C (0.5 M NaCl – halophilic bacteria, colony = pink, slow growth)
  6. Sporosarcina sp. 八連球菌の1種: OGT = 24°C
  7. Vibrio sp. ABE-1: OGT = 15°C, 25°C以上で成長できない
染色 staining (含, グラム染色)
試薬
  1. Fuchsin liquid: ca 11 g fuchsin + 100 ml absolute ethanol
  2. Methylene blue liquid: ca 5 g methylene blue + 100 ml absolute ethanol
  3. Gentian violet liquid: 7 g gentian violet + 100 ml absolute ethanol
  4. Gramのヨード液: 1 g indigo + 2KI + 100 ml water
  5. 95% ethanol
  6. 5% chroric acid
  7. 1-3% H2SO4
  8. 5% phenol
染色液
  1. Loeffer’s methylene blue: 30 ml (2) + 100 ml (8) → filtration
  2. Carbal fuchsin: 10 ml (1) + 100 ml (3)
  3. Dilute carbal fuchsin: (b)を5-10倍に希釈
  4. Carbal gentien: 10 ml (3) + 100 ml (9)
染色共通部分: 以下の処理後、各染色手順に入る
スライドガラス (slide or cover glass)に水を一滴垂らす → slantより菌を白金耳でとりslide glassにこすりつける(水滴が均一に薄く濁る程度に) → 風乾
固定: 風乾したものをバーナーの上の炎中を1, 2往復させる
単純染色 simple staining
染色液乗せる(Methylene blue = 30-60 sec., Dilute fuchsin = 30 sec.) → 水洗: ビーカに水道水を入れ軽く濯ぐ(菌付着面の反対面に緩く水が当たるよう流水洗浄でも可) → 風乾 → 検鏡: カナダバルサム包埋
胞子染色 spore staining
脱脂: 5% chromatic acidを乗せる(1-3 min) → 水洗 → 加温染色: carbal fuchsinを乗せ2-3 sec.バーナ上にかざす → 自然にさます → 水洗 → 脱色: 1-3% H2SO4を乗せる(2-5 sec) → 直ちに水洗 → 染色: methylene blueを乗せる(30-60 sec) → 水洗 → 風乾 → 検鏡

総じて時間を計っておくと、後々便利

(西沢・菅原)

鞭毛染色
鞭毛への硝酸銀付着が目的。鞭毛が水洗中取れ易く注意
材料: Pseudomonus sp.
試薬
  • 第1液: Distilled water (100 ml) + タンニン酸 (5 g) + 50%塩化第II鉄 (1.5 ml) + ホルマリン (2.0 ml)
  • 第2液: Distilled water (100 ml) + 硝酸銀 (2.0 ml) + 28% 高方アンモニア水 (少量)
100 ml硝酸銀液から10 mlをとり、アンモニア水を加え始め最初にできた混濁が消えた所で止める
残り90 mlの硝酸銀を加える

手順: 1: 若いslantに滅菌水2-3 ml入れ1-2 hr放置.   2: 菌泳ぎ出し滅菌水薄く白濁したものをピペットで少量とりslide glassに乗せる.   3: 風乾(火焔滅菌と固定しない).   4: 媒染・固定: 第1液を乗せ2-3 min放置.   5: 静かに水洗.   6: 染色: 第2液を載せる(数秒).   7: 水洗.   8: 風乾.   9: 検鏡

水中菌観察

理学部水道水(地下水)を無菌的に採取し菌数測定
準備: 300 mlフラスコ、広口瓶、スプレッダー、寒天オートクレーブ
手順
  1. 蛇口滅菌: 水を勢い良く出し蛇口洗浄(or アルコールランプで熱し水を1-2分出してから排水)
  2. プレート作成
    1. Pour plate: 原液、10倍希釈液を0.5, 1.0 mlとり無菌シャーレ(流したら良く混ぜる)に入れ溶かした高層寒天に流し込む
    2. Spread plate: 原液、希釈液0.1, 0.2 mlを手板プレートにたらし、スプレッダーで均一に広げる
  3. 培養24°C
  4. コロニー数カウント(一定時間間隔で)

脂質分析法 (lipid analysis methods)


脂質の細胞中の存在場所選択
エーテル・クロロフォルム・ベンゼン・エタノール・メチルアルコール・アセトン等で抽出

有機溶媒として一般にエーテル・エタノールの混合物を使用し、酵素変成を避けるために室温で抽出
有機溶媒に対する溶解度が室温で最適になるように溶媒を選定

抽出後、ロータリーエバポレーター等を用いて真空溶媒蒸発を行う。ある程度高温の方がよい
脂質の種類により適当な溶媒に溶かし、カラムクロマトグラフィー・PC・TLC・GC等を用い分離・固定

細菌からの脂質抽出分析

目的: 脂質抽出原理を理解し技術を獲得。定性分析を行い脂質の特徴理解
材料: Pseudomonas aeruginosa (緑膿菌): 薄緑色蛍光を発する
→ 手順 (procedure)
濃度 concentration
クロロフォルム層をナス型フラスコに取りロータリーエバポレーターで濃縮 (< 25°C)

→ 乾固直前にロータリーエバポレーターを止め脂質を目盛付試験管に移す。ナス型フラスコにクロロフォルムを適量(毎回同量)加え壁面を洗う(3回繰り返す)

注) 事前に遠心管の重量を(cold room or ice bath等の)低温下で計っておく

共栓は試験管にN2-gasと一所に封入。保存の際には-20°C

定量: 最終産物1 mlを秤量ビンに取りロータリーエバポレーターでchroloformをとばした後、2日間乾燥させdry weightを算出。今回サンプルは3つ用意。ブランクは1 ml NaCl dry weightを測定。別個にDDを測定しておく

結果

           Bacteria W.W  Blank      B.W.W.-Blank  Lipid
    20°C  0.01403 g     0.00057 g  0.01346 g     0.00213 g
    37°C  0.01657       0.00057    0.01600       0.00420
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